王春雷， 高季平， 趙憲坤

(揚(yáng)州大學(xué)園藝與植物保護(hù)學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州 225009)

梨是典型的自交不親和性果樹，生產(chǎn)上通常需要配置花期一致、S基因型不同的品種作為授粉樹。目前，常見梨樹品種的S基因型大多被鑒定。但在生產(chǎn)和育種工作中梨樹品種S基因型鑒定仍然必不可少。比如，育種獲得的梨樹新品種及新發(fā)現(xiàn)的地方品種，這些品種的S基因型就需要鑒定。

薔薇科李屬果樹S基因型可以通過SFB序列或者S-RNase序列確定。但與李屬植物不同，梨屬花粉S基因至今還沒有確定。因此，梨屬植物的S基因型只能根據(jù)S-RNase序列判斷。梨屬S基因具有5個保守區(qū)域，分別是C1區(qū)、C2區(qū)、C3區(qū)、C5區(qū)以及薔薇科植物特有的RC4區(qū)，此外還有一個高變區(qū):RHV區(qū)。根據(jù)S-RNase基因結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，開發(fā)出大量以PCR技術(shù)為基礎(chǔ)的果樹S基因型鑒定法，最常用的是PCR電泳法。但是此方法有一些弊端，例如該方法很難區(qū)分長度相似的S等位基因［1-2］，利用半自動測序儀雖然能精確確定PCR產(chǎn)物大小，但是這種半自動測序儀價格昂貴，不適合推廣［1-3］，圓點(diǎn)雜交也是利用探針檢測PCR產(chǎn)物，但是圓點(diǎn)雜交操作難度大，測試周期長［4］。

PCR-酶聯(lián)免疫分析技術(shù)開發(fā)于上世紀(jì)80年代，主要用于診斷植物病害和人類疾?。?-7］，也可以用來檢測單核苷酸多態(tài)性 。在該方法中，PCR產(chǎn)物的序列通過探針雜交來檢測，并通過免疫反應(yīng)來檢測探針是否與PCR產(chǎn)物結(jié)合。本研究擬建立一種基于PCR-酶聯(lián)免疫反應(yīng)鑒定梨樹S基因型的新方法。

1 材料與方法

1.1 材料

本試驗(yàn)所用8個日本砂梨品種采自揚(yáng)州大學(xué)園藝場，品種名和其S基因型分別為愛宕(S2S5)，愛甘水(S4S5)，二十世紀(jì)(S2S4)，豐水(S3S5)，今村秋(S1S6)，秋榮(S4smS5)，新高(S3S9)和幸水(S4S5)。這些品種包含7個等位基因和1個等位基因的突變體。采集各品種花前1～2 d的花蕾收集花柱，每20朵花的花柱存于1個1.5 ml離心管中，貯于－70℃冰箱中備用。

表1 探針和引物序列Table 1 The sequences of probes and primers

1.2 方法

1.2.1 RNA提取及cDNA制備 從－70℃冰箱中取出花柱，花柱總RNA提取使用SV 96 total RNA isolation system試劑盒(Promega，USA);cDNA合成使用iScriptTMcDNA合成試劑盒(BioRad，USA)，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 引物和探針制備 本試驗(yàn)所需引物和單鏈核苷酸探針序列如表1所示，該對引物正向引物經(jīng)生物素(Biotin)標(biāo)記，引物擴(kuò)增獲得的產(chǎn)物大小在450 bp左右，該產(chǎn)物包含S-RNas e等位基因的高變區(qū)(RHV)。各S基因等位基因單鏈核苷酸探針主要是根據(jù)各S等位基因RHV區(qū)域序列設(shè)計獲得，各探針Tm值均為60℃。用于檢測PCR產(chǎn)物的探針，除了包含S等位基因探針序列，還包括一個6 bp的TATATT間隔序列和一個23 bp的檢測序列(5'-TACATTCGCAATTGAGGCTTCGT-3')，該檢測序列與地高辛(Digoxin)標(biāo)記的檢測探針序列互補(bǔ)。雜交的原理如圖1所示。

1.2.3 序列雜交 各品種S等位基因DNA片段通過PCR擴(kuò)增獲得。PCR反應(yīng)體系為:50μl反應(yīng)體系中加入20 ng cDNA，20 pmol正反向引物，1×Ex Taq緩沖液，400 μmol/L dNTPs，2.5 U Ex Taq DNA聚合酶(TaKaRa Biomedicals，Japan)。PCR擴(kuò)增40個循環(huán)，每個循環(huán)包括94℃ 變性30 s，55℃ 退火30 s，72℃ 延伸 1 min。反應(yīng)結(jié)束后，每5μl PCR產(chǎn)物添加100μl PBST緩沖液和50μg鏈酶親和素包裹的磁力球(Roche，Germany)，94℃孵育30 min。隨后，加入50μl變性溶液(0.5 mol/L NaOH，10 mmol/L EDTA)，使磁力球結(jié)合的PCR產(chǎn)物變成單鏈，PBST緩沖液沖洗2遍。再加入200μl雜交緩沖液(5×SCC 緩沖液，0.3%Tween-20，50 pmol S等位基因探針和地高辛標(biāo)記的檢測探針)，50℃雜交2 h。PBST緩沖液清洗2遍，與含1%抗地高辛堿性磷酸酶(Anti-digoxigenin IgG Fab fragment conjugated with alkaline phosphatase，Roche，Germany)的 PBST緩沖液室溫孵育30 min。PBST清洗2次后，再與PNPP(Thermo，USA)在37℃反應(yīng)，根據(jù)顏色變化判斷雜交結(jié)果，如果呈黃綠色，表示該S等位基因探針與PCR產(chǎn)物互補(bǔ)，即該品種包含1個該S基因型。

圖1 PCR-ELSIA梨樹S基因型鑒定法流程示意圖Fig.1 Schemes of S genotyping in pear by PCR-ELSIA method

2 結(jié)果

在本試驗(yàn)中，我們一共設(shè)計了7個單鏈核苷酸探針，各探針分別與Pyrus pyrifolia S-RNase中的S1、S2、S3、S4、S5、S6和 S7等位基因特異互補(bǔ)。探針序號與其對應(yīng)的等位基因序號相同。完成所有試驗(yàn)步驟后，如果該溶液呈黃綠色，表明PCR產(chǎn)物與該S等位基因特異結(jié)合，即測試品種擁有此S等位基因。

試驗(yàn)中，一共測試了8個品種，除品種秋榮外，每一個品種花柱RNA反轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA擴(kuò)增獲得的PCR產(chǎn)物都能與2個探針互補(bǔ)雜交結(jié)合(圖2)。其中愛宕能與探針2和探針5結(jié)合，愛甘水能與探針4和探針5結(jié)合，二十世紀(jì)能與探針2和探針4結(jié)合，豐水能與探針3和探針5結(jié)合，今村秋能與探針1和探針6結(jié)合，新高能與探針3和探針9結(jié)合，幸水能與探針4和探針5結(jié)合。雜交結(jié)果符合各品種S基因型。因?yàn)镾4sm在秋榮花柱中不表達(dá)，所以秋榮PCR產(chǎn)物只與探針5呈陽性反應(yīng)。其他無探針結(jié)合雜交，溶液則無明顯顏色反應(yīng)。

圖2 PCR-ELSIA梨S基因型鑒定探針雜交后PNPP顏色反應(yīng)結(jié)果Fig.2 The coloring reaction with PNPP of Sgenotype by PCRELISA after probe hybridation

3 討論

S基因型鑒定是果樹栽培中一項重要任務(wù)，它為果園授粉樹的配置提供依據(jù)。S基因型鑒定最早是通過觀察授粉后坐果率或者花粉管生長情況獲得，隨后該方法被更加快速、可靠的PCR擴(kuò)增法取代。目前，最常用的方法就是通過通用引物擴(kuò)增，電泳鑒定PCR產(chǎn)物大小的方法判斷S基因型。這種方法缺陷是不能區(qū)分大小相近的S等位基因［9-11］。為了解決這個問題，有學(xué)者提出使用半自動測序儀精確測定 PCR 產(chǎn)物大?。?-3，12］，該方法可以精確分辨產(chǎn)物1 bp大小差別，但是該方法需要使用昂貴的儀器。本研究利用等位基因特異探針鑒定PCR產(chǎn)物，不需要昂貴儀器，與半自動測序儀法相比更易操作。此外，Kitashiba等［4］開發(fā)出一種圓點(diǎn)雜交法鑒定果樹S基因型方法，但此方法過于靈敏，需要通過預(yù)備試驗(yàn)，獲得每個探針最適雜交溫度，否則會產(chǎn)生假陽性反應(yīng)。

我們曾經(jīng)利用相似原理鑒定李子和櫻桃S基因型［13］。李子和櫻桃S基因型鑒定，既可以通過花粉自交不親和性因子SFB基因序列鑒定，也可以通過花柱自交不親和性因子S-RNase基因序列鑒定。本研究，我們又運(yùn)用該方法鑒定梨樹S基因型。梨樹S基因型只能根據(jù)S-RNase基因序列判斷，這主要是因?yàn)槔婊ǚ跾基因至今未被鑒定。在李子、櫻桃S基因型鑒定中，因?yàn)樵诟咦儏^(qū)存在500 bp以上內(nèi)含子，我們根據(jù)所有等位基因序列設(shè)計1個正向通用引物和多個等位基因特異反向引物，再利用多引物PCR擴(kuò)增梨品種S-RNase高變區(qū)。在多引物PCR中，存在引物之間相互影響，我們根據(jù)S-RNase基因編碼區(qū)設(shè)計了1對通用引物，利用花柱RNA反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA作為PCR模板，擴(kuò)增S-RNase基因高變區(qū)，不存在多引物干擾問題，同時回避了多數(shù)梨S-RNase基因沒有內(nèi)含子序列的問題。除秋榮外，所有品種都與2個探針呈陽性反應(yīng)，結(jié)果與各品種的S基因型一致，表明該方法非?？煽?。品種秋榮所含S4sm-RNase基因發(fā)生突變，在花柱中不表達(dá)，因此無法檢測到其信號。

在該方法中，用于檢測S基因型的探針都包含3段序列，第1段是與各S基因型對應(yīng)的等位基因互補(bǔ)序列，第2段是與地高辛標(biāo)記的檢測探針互補(bǔ)的檢測序列，第3段是分隔上述兩部分的間隔序列。S-RNase等位基因探針通過與地高辛標(biāo)記檢測探針雜交結(jié)合間接獲得地高辛標(biāo)記。通過這種設(shè)計，避免每個探針都用地高辛標(biāo)記，只需合成1個地高辛標(biāo)記的檢測探針，從而大大降低試驗(yàn)成本，尤其在多個探針時，更能體現(xiàn)出該方法的經(jīng)濟(jì)性。

雖然在我們試驗(yàn)中，由于材料限制只選取了8個品種，7個S基因型，但我們在設(shè)計引物和探針時，比較了數(shù)據(jù)庫中所有梨S基因型，保證各探針的特異性。在對梨品種S基因型進(jìn)行鑒定時，可將已經(jīng)公布的S等位基因分成多個組，以組為單位分別檢測，從而減少工作量。

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