龐有志， 白俊艷， 張小輝， 趙淑娟， 吳勝軍， 于美琴， 許華偉

(河南科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，河南 洛陽(yáng) 471003)

微衛(wèi)星(Microsatellite)又稱簡(jiǎn)單重復(fù)序列，是一種以2～6 bp核苷酸為基本單位，呈串聯(lián)重復(fù)隨機(jī)分布于原核和真核生物基因組中的高度重復(fù)序列［1-4］。微衛(wèi)星標(biāo)記具有多態(tài)性豐富且在基因組中分布均勻、檢測(cè)方便和共顯性遺傳等優(yōu)點(diǎn)。在鵪鶉遺傳育種方面微衛(wèi)星標(biāo)記主要應(yīng)用于遺傳圖譜的構(gòu)建［5］、鵪鶉功能基因和 QTL 定位［6］、遺傳多樣性分析［7］等方面。北京白羽鵪鶉是朝鮮鵪鶉的一個(gè)突變系，是中國(guó)自行培育的高產(chǎn)蛋用品系，因其白羽性狀具有性連鎖遺傳的特點(diǎn)，該品系作為配套系的父本，與朝鮮鵪鶉、中國(guó)黃羽鵪鶉廣泛用于自別雌雄配套系生產(chǎn)［8］。本研究利用9對(duì)微衛(wèi)星標(biāo)記對(duì)北京白羽鵪鶉群體進(jìn)行多態(tài)性檢測(cè)，旨在為北京白羽鵪鶉的遺傳資源的評(píng)價(jià)、保護(hù)和利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品采集 在河南科技大學(xué)試驗(yàn)?zāi)翀?chǎng)，隨機(jī)抽取80只北京白羽鵪鶉，每只心臟采血2 ml，血樣采用檸檬酸葡萄糖(ACD)抗凝，血液∶ACD為6∶1(體積比)。－20℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 引物的選擇及合成 從國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)上篩選多態(tài)性比較高且每個(gè)基因座至少有4個(gè)等位基因的微衛(wèi)星基因座，確定了9個(gè)微衛(wèi)星基因座作為本次研究的遺傳標(biāo)記(表1)。引物序列送上海生工生物工程有限公司合成。

表1 9個(gè)微衛(wèi)星基因座的相關(guān)信息Table 1 Information for 9 microsatellite loci

1.2 方法

1.2.1 PCR反應(yīng)條件 PCR反應(yīng)體系總體積為12.50 μl，其中 ddH2O 8.65 μl，10 × Buffer 1.25 μl，Mg2+(25 mmol/L)0.75 μl，DNA 模板 0.50 μl，上、下游引物各0.50 μl(10 mmol/L)，dNTPs 0.25 μl，Taq酶0.10μl。PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序:95℃預(yù)變性3 min;94℃變性45 s，根據(jù)表1的退火溫度退火60 s，72℃延伸60 s，30次循環(huán);最后72℃延伸12 min，4℃保存。

1.2.2 擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)及聚丙烯酰胺凝膠電泳 擴(kuò)增產(chǎn)物用1.0×TBE電泳緩沖液配制成的1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行檢測(cè)。以DNA marker I作對(duì)照，在紫外透射分析儀上觀察，選擇特異性條帶明亮而且雜帶很少的樣品，進(jìn)行8%非變性丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)，120 V電泳2 h左右，硝酸銀染色后用成像儀拍照保存并分析。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)pBR322DNA/MspⅠMarker，檢測(cè)等位基因片段大小，確定各微衛(wèi)星基因座全部個(gè)體的基因型。

1.2.3 統(tǒng)計(jì)分析 通過(guò)分子生物學(xué)軟件POPGENE(Version1.32)分析每個(gè)基因座的多態(tài)信息含量(PIC)、有效等位基因數(shù)(Ne)、雜合度(H)。

2 結(jié)果

2.1 微衛(wèi)星基因座聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果

9個(gè)微衛(wèi)星基因座在北京白羽鵪鶉群體中均具有明顯的多態(tài)性，其中微衛(wèi)星基因座GUJ0028和GUJ0029電泳圖結(jié)果見圖1、圖2。從圖1、圖2可以看出微衛(wèi)星基因座GUJ0028和GUJ0029具有豐富的多態(tài)性。

圖1 微衛(wèi)星基因座GUJ0028的PCR產(chǎn)物電泳圖Fig.1 Banding patterns of PCR product of GUJ0028 microsatelite

圖2 微衛(wèi)星基因座GUJ0029的PCR產(chǎn)物電泳圖Fig.2 Banding patterns of PCR product of GUJ0029 microsatelite

2.2 微衛(wèi)星等位基因數(shù)及基因頻率

9個(gè)微衛(wèi)星基因座在北京白羽鵪鶉群體中共檢測(cè)到43個(gè)等位基因，平均等位基因數(shù)為4.777 8(表2)。其中 GUJ0023、GUJ0029、GUJ0077均檢測(cè)到 6個(gè)等位基因，基因片段分別為 219～244 bp、147～175 bp、260 ～ 285 bp;GUJ0028、GUJ0057、GUJ0097均檢測(cè)到5個(gè)等位基因，基因片段分別為160～185 bp、147～170 bp、130～170 bp;GUJ083檢測(cè)到4個(gè)等位基因，基因片段為 130～155 bp;GUJ059和GUJ0063均檢測(cè)到3個(gè)等位基因，基因片段分別為240 ～246 bp、242 ～246 bp。

微衛(wèi)星位點(diǎn) GUJ0023、GUJ0028、GUJ0029、GUJ0057、GUJ0059、GUJ0063、GUJ0077、GUJ0083 和GUJ0097在北京白羽鵪鶉群體中分別有15、12、15、13、9、4、14、9、17 種基因型。GUJ0023、GUJ0028、GUJ0029、GUJ0057、GUJ0059、GUJ0063、GUJ0077、GUJ0083和 GUJ0097優(yōu)勢(shì)基因分別為 240、170、175、160、246、244、280、147、155，優(yōu)勢(shì)基因型分別為242/238、185/170、175/160、162/162、246/246、244/244、280/280、147/147、155/155。

表2 9個(gè)微衛(wèi)星的等位基因大小和頻率Table 2 Allele size and frequencies of 9 microsatellite loci

2.3 微衛(wèi)星基因座的基因雜合度和多態(tài)信息含量

由表3可以看出，在北京白羽鵪鶉群體中微衛(wèi)星基因座GUJ0023多態(tài)信息含量、有效等位基因數(shù)和雜合度均為最高，分別為0.751 9、4.659 8和0.785 4。9個(gè)微衛(wèi)星在北京白羽鵪鶉群體中平均多態(tài)信息含量、有效等位基因數(shù)、雜合度分別為0.658 7、3.613 5、0.704 6。GUJ0023 和 GUJ0029 在白羽鵪鶉群體中的χ2值小于χ20.01，符合哈迪-溫伯格定律，其余均偏離哈迪-溫伯格平衡定律。

表3 9個(gè)微衛(wèi)星的等位基因數(shù)、多態(tài)信息含量、有效等位基因數(shù)、雜合度Table 3 Number of alleles，polymorphism information content(PIC)，effective alleles and heterozygosity of 9 microsatelliate loci

3 討論

有效等位基因數(shù)是純合度的倒數(shù)，反映微衛(wèi)星位點(diǎn)上所有等位基因之間的相互影響程度。有效等位基因數(shù)越接近所檢測(cè)到的等位基因的絕對(duì)數(shù)，表明等位基因在群體中分布越均勻。本研究中9個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記在北京白羽鵪鶉群體中有效等位基因數(shù)最小為2.103 0，最大達(dá)4.659 8，反映出9個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記的等位基因在群體中分布不均勻。

多態(tài)信息含量(PIC)是衡量等位基因片段多態(tài)性的理想指標(biāo)，當(dāng)PIC≥0.50時(shí)表明該基因座為高度多態(tài)基因座，0.25≤PIC＜0.50時(shí)表明該基因座為中度多態(tài)基因座，PIC＜0.25時(shí)表明該基因座為低度多態(tài)基因座［9］。本研究中除了GUJ063(PIC=0.463 9)在北京白羽鵪鶉群體中為中度多態(tài)性基因座外，其余8個(gè)微衛(wèi)星基因座均為高度多態(tài)基因座，表明這8個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記均可以作為北京白羽鵪鶉群體的有效遺傳標(biāo)記進(jìn)行遺傳多樣性分析。

遺傳雜合度表示在微衛(wèi)星基因座上雜合子個(gè)體占群體的比例，它反映微衛(wèi)星基因座在群體中的遺傳變異程度。雜合度越高，表明群體內(nèi)遺傳多樣性就越高，遺傳變異程度就越大，反之則群體內(nèi)遺傳變異程度就小。吳勝軍等［10］用同樣的9個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記研究了朝鮮鵪鶉群體的遺傳多樣性，其平均雜合度為0.709 6，平均多態(tài)信息含量為0.663 9，而本研究中北京白羽鵪鶉的平均雜合度和多態(tài)信息含量分別為0.704 6和0.658 7，可以看出北京白羽鵪鶉的變異程度略低于朝鮮鵪鶉，這可能與北京白羽鵪鶉所受到較高的選擇強(qiáng)度有關(guān)。北京白羽鵪鶉由朝鮮鵪鶉分化而來(lái)，培育至今已有20余年，比較兩者優(yōu)勢(shì)基因即可以看出兩群體分化的差異，在所研究的9個(gè)微衛(wèi)星基因座中，北京白羽鵪鶉在GUJ0023、GUJ0028、GUJ0029、GUJ0057、GUJ0059、GUJ0063、GUJ0077、GUJ0083和GUJ0097基因座優(yōu)勢(shì)基因分別為 240、170、175、160、246、244、280、147、155;而朝鮮鵪鶉除GUJ0063和GUJ0083兩個(gè)基因座與北京白羽鵪鶉具有相同的優(yōu)勢(shì)基因外，其他7個(gè)微衛(wèi)星基因座優(yōu)勢(shì)基因都發(fā)生了變化，這提示我們北京白羽鵪鶉從朝鮮鵪鶉分離純化后發(fā)生了一些群體變化，而且這種變化在Bai等［11］對(duì)朝鮮鵪鶉的另一種羽色突變系—中國(guó)黃羽鵪鶉的研究中也得到反映。另外，孟慶美等［12］報(bào)道了朝鮮鵪鶉群體中12個(gè)微衛(wèi)星的多態(tài)性，本研究檢測(cè)的9個(gè)微衛(wèi)星中有5個(gè)(GUJ0023、 GUJ0057、 GUJ0059、 GUJ0063 和GUJ0097)與其基因座相同，但檢測(cè)到的基因數(shù)不同，其中有 3個(gè)標(biāo)記(GUJ0057、GUJ0063和GUJ0097)的等位基因數(shù)少于其研究結(jié)果，而另2個(gè)基因座等位基因數(shù)多于其研究結(jié)果。Farrag等［13］研究的13個(gè)微衛(wèi)星在3個(gè)日本鵪鶉品系中的平均雜合度為0.609 0，Hossein等［14］研究的12 個(gè)微衛(wèi)星在日本鵪鶉4個(gè)品系中的平均雜合度為0.434 3左右，而本研究的9個(gè)微衛(wèi)星在北京白羽鵪鶉群體中平均雜合度為0.704 6，表明北京白羽鵪鶉群體的遺傳變異程度明顯高于日本鵪鶉。

χ2檢驗(yàn)結(jié)果表明，本研究測(cè)定的9個(gè)微衛(wèi)星基因座中除GUJ0023和GUJ0029外，其余7個(gè)基因座在北京白羽鵪鶉群體中均極顯著偏離遺傳平衡(P＜0.01)。遺傳平衡與否與檢測(cè)樣本數(shù)有一定關(guān)系，樣本不夠大時(shí)，有些基因座就可能檢測(cè)不到全部等位基因。Baker等［15］指出，在檢測(cè)每個(gè)品種時(shí)，為了避免出現(xiàn)誤差，樣本數(shù)應(yīng)達(dá)到50個(gè)。就本研究而言，樣本數(shù)(80)已經(jīng)達(dá)到抽樣要求，表明遺傳不平衡不是樣本的原因，很可能是北京白羽鵪鶉群體受到過(guò)度人工選擇或近親繁殖等因素的影響，這可能與近年來(lái)對(duì)北京白羽鵪鶉進(jìn)行小群體保種有關(guān)。

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