李隱俠， 喬 永， 張 俊， 錢 勇， 孟春花， 王慧利， 鐘 聲，曹少先， 李齊發(fā)

解偶聯(lián)蛋白質(zhì)(Uncoupling protein，UCPs)是一類位于線粒體內(nèi)膜的質(zhì)子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白質(zhì)，參與機(jī)體的能量代謝。目前，在哺乳動(dòng)物中已發(fā)現(xiàn)的解偶聯(lián)蛋白質(zhì)基因家族成員包括 UCP1、UCP2、UCP3、UCP4和UCP5，其中UCP3基因在嚙齒類動(dòng)物和人類的骨骼肌、白色脂肪組織、棕色脂肪組織及心肌中均有表達(dá)，尤其是在骨骼肌中高效、專一表達(dá)，是骨骼肌線粒體內(nèi)膜的重要轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白質(zhì)［1-2］，可能參與脂肪代謝的調(diào)節(jié)［3］。UCP3蛋白質(zhì)能夠提供非顫抖的生熱作用，是體內(nèi)產(chǎn)熱的重要調(diào)節(jié)因子，被認(rèn)為是參與骨骼肌能量代謝的重要靶蛋白質(zhì)物質(zhì)，并顯著影響機(jī)體能量平衡涉及的體質(zhì)量(肥胖)、靜止代謝率和體脂代謝等［4］。Liu 等［5］在肥胖人群中發(fā)現(xiàn)，UCP3 基因多態(tài)對體質(zhì)量指數(shù)有顯著影響，表明UCP3多態(tài)使肥胖者體質(zhì)量有增加的危險(xiǎn)。Rudofsky等［6］研究認(rèn)為，人UCP3基因調(diào)節(jié)能量平衡，與肥胖和糖尿病有關(guān)。有研究結(jié)果表明UCP3基因可能是影響豬胴體和肉質(zhì)性狀的主效基因或是與主效基因連鎖的基因標(biāo)記［7］。陳哲等［8］研究發(fā)現(xiàn)UCP3基因第四內(nèi)含子Bcc I多態(tài)位點(diǎn)與長白豬6～7背膘厚極顯著相關(guān)。陳翠等［9］研究發(fā)現(xiàn)西門塔爾牛UCP3基因的Bgl I酶切位點(diǎn)表現(xiàn)多態(tài)性，而且此位點(diǎn)與平均日增質(zhì)量、胴體長、胴體胸深、后腿寬和背膘厚性狀顯著相關(guān)。金成吉等［10］研究發(fā)現(xiàn)，UCP3基因表達(dá)減少與2型糖尿病模型OLETF鼠早期肥胖有關(guān)。本研究以早期生長發(fā)育較快的湖羊?yàn)檠芯繉ο?，克隆測序獲得湖羊UCP3基因編碼區(qū)序列，并對序列特征進(jìn)行分析，解析UCP3基因在湖羊不同部位肌肉中的表達(dá)變化，為綿羊的育種工作提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

試驗(yàn)動(dòng)物為健康純種湖羊，選自江蘇省蘇州市東山湖羊資源保種區(qū)，初生、1、2、3、4、5 和 6 月齡的各5只，共35只羊，試驗(yàn)動(dòng)物由東山湖羊資源保種區(qū)統(tǒng)一飼料管理，營養(yǎng)以及管理水平保持一致。屠宰后記錄屠宰數(shù)據(jù)，采取背最長肌(第12肋骨后)、腰大肌(8～12肋骨處)、前腿肱二頭肌和后腿股二頭肌樣品，迅速置于液氮中保存，帶回后置于－70℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 RNA提取及反轉(zhuǎn)錄

用Trizol法提取各肌肉RNA，紫外分光光度計(jì)測定總RNA濃度和純度(OD260/OD280=1.8～2.0)。

用隨機(jī)引物對總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)體系為25μl:2μg總 RNA，1μg隨機(jī)引物，0.4 mmol/L dNTP，20 U RNAse抑制劑，200 U MMLV反轉(zhuǎn)錄酶，5μl 5×RT buffer(250.0 mmol/L Tris-HCl pH 8.3，50.0 mmol/L MgCl2，250.0 mmol/L KCl，50.0 mmol/L DTT，2.5 mmol/L亞精胺)。先加 RNA模板、dNTP和隨機(jī)引物，70℃變性5 min后立即放冰上冷卻，再加其余試劑，混勻后于41℃下放置40 min。RT產(chǎn)物保存于－20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3 引物設(shè)計(jì)與PCR反應(yīng)

從GenBank中檢索綿羊UCP3(GenBank序列號(hào):KF015729)和GAPDH［看家基因3-磷酸甘油醛脫氫酶基因(GenBank序列號(hào):AF030943)］mRNA序列，用Primer premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物(表1)，由上海捷瑞生物技術(shù)有限公司合成。

反應(yīng)體系為20μl:1μl RT產(chǎn)物，1U Taq DNA聚合酶，2μl 10×PCR buffer(100 mmol/L Tris-HCl pH 8.3，500 mmol/L KCl)，0.5 mmol/L dNTP，1.4 mmol/L MgCl2，上、下游引物各 0.5 μmol/L。反應(yīng)程序?yàn)?94℃預(yù)變性5 min;94℃ 30 s，59℃ 30 s，72℃ 30 s，共35個(gè)循環(huán);最后再72℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳分離，EB染色后用凝膠成像系統(tǒng)照相。

1.4 PCR產(chǎn)物回收及克隆測序

PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳分離，紫外燈下割取目的片斷，用Karroten DNA凝膠回收試劑盒純化。將回收純化的目的片段與PCR 2.1載體充分混勻，在恒溫金屬浴中16℃連接過夜，將全部連接液轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞，涂于含氨芐抗性的LB板37℃過夜培養(yǎng)。挑取單克隆菌提取質(zhì)粒，PCR鑒定 為陽性克隆送美吉生物公司測序。

表1 UCP3基因的引物參數(shù)Table 1 Parameters of oligo-nucleotide primer pairs of UCP3 and GAPDH

1.5 序列分析與系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

用DNAMAN6.0軟件進(jìn)行序列翻譯和與其他動(dòng)物的核苷酸和氨基酸序列進(jìn)行比對。開放閱讀框的預(yù)測在 NCBI的 ORF Finder(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/gorf/)中進(jìn)行，利用 NCBI BLAST服務(wù)器從GenBank中挑選8個(gè)來源于不同動(dòng)物的UCP3所編碼的氨基酸序列，利用 DNAStar軟件進(jìn)行多序列比對分析和編輯校正，采用 MEGA5.1軟件包［11］中的鄰接法(Neighbor-joining，NJ)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，自舉分析(Bootstrap test)采用1 000次重復(fù)抽樣檢驗(yàn)獲得置信度(BP)。

1.6 Real-time PCR

Real-time PCR反應(yīng)體系為20μl:1μl RT產(chǎn)物，1 U Ex Taq HSDNA 聚合酶，4 μl 5 ×PCR buffer，0.30 mmol/L dNTP，3.75 mmol/L MgCl2，上游和下游引物各0.50μmol/L，1μl 20×SYBR greenⅠ。反應(yīng)程序?yàn)?95℃預(yù)變性1 min;95℃ 10 s，退火10 s，72℃ 15 s，45個(gè)循環(huán);然后再72℃延伸5 min。融解曲線分析:65～94℃，每隔0.2℃讀板1次(溫度恒定1 s后讀板);最后72℃延伸5 min。每個(gè)樣品2個(gè)重復(fù)，取平均值進(jìn)行計(jì)算。

圖1 綿羊肌肉UCP3基因克隆擴(kuò)增電泳圖和GAPDH、UCP3基因的RT-PCR電泳圖Fig.1 The amplification profile of UCP3 gene and RT-PCR of GAPDH and UCP3 mRNA in sheep muscle

1.7 數(shù)據(jù)分析

用SPSS11.5 For Windows軟件進(jìn)行分析，其中同一肌肉部位不同月齡間的基因表達(dá)差異用Oneway ANOVA進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 綿羊UCP3基因和GAPDH基因擴(kuò)增結(jié)果

以湖羊肌肉總RNA為模板，用所設(shè)計(jì)的UCP3基因引物P1、P2和P3進(jìn)行基因擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物瓊脂糖電泳圖見圖1。由圖1可以看出，UCP3基因編碼區(qū)序列片段和GAPDH基因片段在湖羊肌肉組織中均有很好的擴(kuò)增。

2.2 綿羊UCP3基因編碼區(qū)序列分析

UCP3基因擴(kuò)增片斷克隆于 PCR2.1載體，PCR鑒定后測序，用 DNAstar對測序結(jié)果與引物設(shè)計(jì)源序列進(jìn)行同源性比較，得到UCP3基因編碼區(qū)全序列。ORF Finder在線軟件預(yù)測發(fā)現(xiàn)測定的序列含有湖羊UCP3基因完整的開放閱讀框，長度為936 bp，編碼311個(gè)氨基酸殘基(圖2)。通過NCBI查找其他哺乳動(dòng)物的UCP3的編碼區(qū)序列，DNAMAN比對發(fā)現(xiàn)湖羊與牛和人的核苷酸序列同源性分別為97.25%、88.61%，氨基酸序列同源性分別為95.63%和87.54%，表明UCP3基因在物種間具有一定的保守性。

圖2 不同哺乳動(dòng)物UCP3基因所編碼的氨基酸序列同源性比較Fig.2 Alignment of amino acid sequences of UCP3 gene from different mammals

2.3 哺乳動(dòng)物UCP3進(jìn)化與系統(tǒng)發(fā)育樹分析

圖3 9個(gè)物種UCP3蛋白質(zhì)氨基酸序列NJ系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree based on nucleotide sequences of UCP3 coding region from nine species by NJ method

以魚類(斑馬魚)為外類群，采用 MEGA 5.1軟件中的NJ法構(gòu)建哺乳動(dòng)物UCP3蛋白質(zhì)的系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果(圖3)顯示聚類結(jié)果與經(jīng)典分類學(xué)結(jié)果基本一致。湖羊與8個(gè)哺乳動(dòng)物聚在一起，而外類群魚類自成一類;在哺乳動(dòng)物中，鼠科自成一類，3種家畜品種和3個(gè)靈長類物種聚在一起;在3種家畜中，湖羊首先和牛聚為一類，然后再與豬聚為一類;而靈長類中的人類、黑猩猩首先聚在一起，然后再和獼猴聚為一類。

2.4 湖羊羔羊不同部位肌肉UCP3基因表達(dá)的變化

用 Real-time PCR 法對湖羊羔羊初生、1、2、3、4、5和6月齡時(shí)背最長肌、腰大肌、前腿肱二頭肌和后腿股二頭肌4個(gè)部位肌肉的UCP3基因mRNA表達(dá)量進(jìn)行分析，結(jié)果(圖4)顯示，UCP3基因mRNA在湖羊羔羊肌肉不同部位中的發(fā)育變化模式基本相似，即在出生時(shí)有較低的水平，然后略有上升，隨著月齡的增加又下降。在背最長肌中，1月齡時(shí)達(dá)到最高，4月齡時(shí)下降到最低;在腰大肌中，剛出生時(shí)UCP3基因表達(dá)水平最低，3月齡時(shí)最高，然后下降;在前腿肱二頭肌中，UCP3基因表達(dá)水平2月齡時(shí)最高，3月齡時(shí)最低;在后腿股二頭肌中，UCP3基因表達(dá)水平出生時(shí)最低，2月齡時(shí)最高。另外，初生至6月齡間UCP3基因在后腿股二頭肌中的整體表達(dá)量偏低，在腰大肌中的表達(dá)水平變化較大，3月齡時(shí)UCP3基因表達(dá)水平顯著高于初生和5月齡。

圖4 湖羊羔羊不同肌肉不同月齡UCP3基因表達(dá)的變化Fig.4 Changes of UCP3 mRNA expression levels in different muscles of differently-aged Hu lamb

3 討論

UCP3作為肌肉組織線粒體內(nèi)膜的重要轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白質(zhì)，對維持肌肉的能量代謝與平衡具有重要的作用［12］。UCP3與肌肉組織中脂肪酸的氧化代謝緊密相關(guān)，研究結(jié)果表明UCP3在肌肉中表達(dá)量的增加能明顯增加肌肉中脂肪酸的氧化，Son等通過轉(zhuǎn)基因的方法使小鼠肌肉高表達(dá)UCP3，發(fā)現(xiàn)UCP3表達(dá)水平高于正常表達(dá)水平18倍的小鼠能明顯減少因飲食增加引起的肥胖，認(rèn)為UCP3可能是未來治療肥胖疾病的1個(gè)有用工具 。Nakayama等研究結(jié)果表明UCP3基因55C/T位點(diǎn)多態(tài)性影響日本成年人的肥胖［14］。Udaqawa等研究結(jié)果表明UCP3基因與家犬體內(nèi)總膽固醇水平相關(guān)［15］。人的UCP3基因位于11q13，包含6個(gè)外顯子和5個(gè)內(nèi)含子［16］;豬的UCP3基因定位在9P21～P24，開放閱讀框?yàn)?36 bp，編碼311個(gè)氨基酸殘基［17］。本研究獲得了湖羊UCP3基因編碼區(qū)序列，湖羊中UCP3基因編碼區(qū)長度為936 bp，編碼311個(gè)氨基酸殘基，其起始密碼子為ATG，終止密碼子為TGA，在哺乳動(dòng)物間是相對保守的［16］。Esterbauer等［18］研究發(fā)現(xiàn)人UCP3基因存在長型和短型2種剪接體，而鼠類中只有長型UCP3基因剪接體，沒有檢測到短型的UCP3，本研究在湖羊中也只發(fā)現(xiàn)1種剪接方式。根據(jù)UCP3蛋白質(zhì)序列構(gòu)建的哺乳動(dòng)物系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果顯示，聚類結(jié)果與經(jīng)典的分類結(jié)果基本一致，即湖羊與8個(gè)哺乳動(dòng)物聚在一起，而外類群魚類自成一類;在哺乳動(dòng)物中，鼠科自成一類，3種家畜和3個(gè)靈長類物種聚在一起;在3種家畜中，湖羊首先和牛聚為一類，然后再與豬聚為一類，此分類結(jié)果與李隱俠等［19］研究結(jié)果一致。

UCP3基因在肌肉中的表達(dá)受多種因素的影響，品種、營養(yǎng)水平和環(huán)境溫度等都會(huì)影響其表達(dá)。Mostyn 等［20］研究了出生后0、4、7、14 和21 日齡時(shí)商品豬和梅山豬UCP3基因表達(dá)模式，發(fā)現(xiàn)在脂肪組織中，7日齡以前2個(gè)品種豬UCP3的表達(dá)量相似，7日齡以后梅山豬顯著高于商品豬，表明UCP3基因表達(dá)具有品種特異性。本研究發(fā)現(xiàn)，湖羊羔羊肌肉UCP3的表達(dá)模式在不同部位具有較明顯的差異，在背最長肌中，出生時(shí)UCP3表達(dá)量較高，然后緩慢上升后下降，到4月齡時(shí)最低，然后又有所回升;在腰大肌和后腿股二頭肌中，剛出生的羔羊UCP3表達(dá)量較低，隨月齡的增加上升，腰大肌在3月齡時(shí)升到最高，股二頭肌在5月齡時(shí)升到最高;在前腿肱二頭肌中，出生時(shí)較高，1月齡時(shí)下降，到2月齡時(shí)升到最高，3月齡時(shí)又降到最低，4月齡時(shí)又上升，表現(xiàn)出波動(dòng)變化的特征，表明UCP3基因在湖羊肌肉中表達(dá)的變化呈明顯的組織特異性，與前人的研究結(jié)果一致［20-21］。UCP3基因在腰大肌中3月齡時(shí)的基因表達(dá)水平顯著高于0月齡和5月齡，表明UCP3基因可能參與脂肪代謝的調(diào)節(jié)［3］。

以上研究結(jié)果表明，湖羊UCP3基因編碼區(qū)長度為936 bp，編碼311個(gè)氨基酸殘基，在哺乳動(dòng)物間相對保守;根據(jù)UCP3蛋白質(zhì)序列構(gòu)建的哺乳動(dòng)物進(jìn)化樹結(jié)果與經(jīng)典的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)一致;UCP3基因在湖羊肌肉中的mRNA的表達(dá)變化具有明顯的組織特異性。

［1］ BOSS，SAMEC S，PAOLONI-GIACOBINO A，et al.Uncoupling protein-3:a new member of the mitochondrial carrier family with tissue-specific expression［J］.FEBSLetters，1997，408:39-42.

［2］ GONG DW，HE Y，KARASM，et al.Uncoupling protein-3 is a mediator of thermogenesis regulated by thyroid hormone，β3-adrenergic agonist，and leptin［J］.The Journal of Biological Chemistry，1997，272:24129-24132.

［3］ HIMMS-HAGEN J，HARPER M E.Physiological role of UCP3 may be export of fatty acids from mitochondria when fatty acid oxidation prodomintaes:an hypothesis［J］.Experimental Biology and Medicine，2001，226:78-84.

［4］ 李 波，李 華，李學(xué)偉，等.豬解偶聯(lián)蛋白3(UCP3)基因的研究進(jìn)展［J］.黑龍江畜牧獸醫(yī)，2006(8):28-30.

［5］ LIU Y J，LIU P Y，LONG J.Linkage and association analyses of the UCP3 gene with obesity phenotypes in Caucasian families［J］.Physiol Genomics，2005，22(2):197-203.

［6］ RUDOFSKY G J，SCHROEDTER A，SCHLOTTERER A，et al.Functional polymorphisms of UCP2 and UCP3 are associated with a reduced prevalence of diabetic neuropathy in patients with type I diabetes［J］.Diabetes Care，2006，29(1):89-94.

［7］ 涂榮劍，鄧昌彥，熊遠(yuǎn)著.豬UCP3基因部分編碼區(qū)域序列分析及單核苷酸多態(tài)與胴體、肉質(zhì)性狀的遺傳效應(yīng)［J］.遺傳學(xué)報(bào)，2004，31(8):807-812.

［8］ 陳 哲，于峰祥，于建寧，等.豬UCP3基因第4內(nèi)含子Bcc I多態(tài)性檢測及其與胴體和肉質(zhì)性狀的關(guān)聯(lián)分析［J］.江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2012，28(6):1338-1343.

［9］ 陳 翠，張立敏，陳曉杰，等.UCP3基因遺傳多態(tài)性與中國西門塔爾牛生長及育肥性狀的遺傳效應(yīng)分析［J］.中國農(nóng)學(xué)通報(bào)，2012，28(5):13-18.

［10］金成吉，王曉梅，李 湘，等.UCP1蛋白和UCP3基因表達(dá)減少與OLETF鼠早期肥胖有關(guān)［J］.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床，2011，3(31):286-290.

［11］ TAMURA K，PETERSON D，PETERSON N，et al.MEGA5:molecular evolutionary genetics analysis using maximum likelihood， evolutionarydistance，and maximum parsimony methods［J］.Mol Biol Evol，2011，28(10):2731-2739.

［12］李秋玲，許尚忠，昝林森，等.3個(gè)牛品種UCP3基因第5內(nèi)含子和第6外顯子部分序列的多態(tài)性研究［J］.西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)，2006，11(34):11-14.

［13］ SON C，HOSODA K，ISHIHARA K，et al.Reduction of diet-induced obesity in transgenic mice overexpressing uncoupling protein 3 in skeletal muscle［J］.Diabetologia，2004，47:47-54.

［14］ NAKAYAMA K，MIYASHITA H，IWAMOTO S.Seasonal effects of the UCP3 and the RPTOR gene polymorphisms on obesity traits in Japanese adults［J］.JPhysiol Anthropol，2014，33(1):38.

［15］ UDAGAWA C，TADA N，ASANO J，et al.The genetic association study between polymorphisms in uncoupling protein 2 and uncoupling protein 3 and metabolic data in dogs［J］.BMC Res Notes，2014，7:904.

［16］ SOLANESG，VIDAL-PUIGA，GRUIICD，et al.The human uncoupling protein-3 gene，genomic structure，chromosomal localization，and genetic basis for short and long form transcripts［J］.J Biol Chem，1997，272(41):25433-25436.

［17］ CEPICA S，YERLE M，STRATIL A，et al.Regional localization of porcine MYOD1，MYF5，LEP，UCP3 and LCN1 genes［J］.Anim Genet，1999，30(6):476-478.

［18］ ESTERBAUER H，OBERKOFLER H，KREMPLER F，et al.The uncoupling protein-3 gene is transcibed from tissue-specific promoters in humans but not in rodents［J］.J Biol Chem，2000，275:36394-36399.

［19］李隱俠，張 俊，李靜心，等.烏骨綿羊NR5A2基因編碼區(qū)序列克隆及特征分析［J］.江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2014，30(6):1375-1382.

［20］ MOSTYN A，LITTEN JC，PERKINSK S，et al.Influence of size at birth on the endocrine profiles and expression of uncoupling proteins in subcutaneous adipose tissue，lung，and muscle of neonatal pigs［J］.Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol，2005，288(6):1536-1542.

［21］ MOSTYN A，LITTEN J C，PERKINS K S，et al.Influence of genotype on the differential ontogeny of uncoupling protein 2 and 3 in subcutaneous adipose tissue and muscle in neonatal pigs［J］.J Endorinol，2004，183:121-131.