朱淑斌， 周春寶， 韓大勇， 倪黎綱，2， 陶 勇， 趙旭庭， 王平安

(1.江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院，江蘇 泰州 225300;2.姜曲海豬保種場，江蘇 泰州 225300)

隨著生活水平的不斷提高，人們對畜產(chǎn)品品質(zhì)的要求也不斷提高。豬肉作為人膳食中的重要組成部分，其質(zhì)量更是人們一直關(guān)注的重點(diǎn)，高蛋白、低脂肪、低膽固醇、鮮嫩多汁的鮮豬肉在市場最受消費(fèi)者歡迎。

FoxO轉(zhuǎn)錄因子是Fox家族的亞家族成員，在哺乳動物中主要有 FoxO1、FoxO3、FoxO4和FoxO6，每種蛋白質(zhì)均高度保守［1］。FoxO轉(zhuǎn)錄因子具有廣泛的生物學(xué)效應(yīng)，對機(jī)體的多個(gè)組織，如肌肉組織、脂肪組織和肝臟等都起著重要調(diào)控作用［2-3］。豬的FoxO1基因定位于11號染色體，含有2個(gè)外顯子和1個(gè)內(nèi)含子。王玲研究發(fā)現(xiàn)牛FoxO1基因單倍型組合與肌內(nèi)脂肪含量、剪切力、肌纖維直徑和肌纖維密度存在不同程度的相關(guān)性［4］。

本研究利用PCR-RFLP方法對地方豬種姜曲海豬的FoxO1基因多態(tài)型以及FoxO1基因?qū)ωi肉質(zhì)性狀的遺傳效應(yīng)進(jìn)行分析，旨在尋找與姜曲海豬肉質(zhì)性狀相關(guān)的遺傳標(biāo)記，為提高肉質(zhì)的研究工作探尋更為簡便有效的方法，并進(jìn)一步為姜曲海豬地方豬種種質(zhì)資源特性及標(biāo)記輔助選擇(MAS)研究提供分子生物學(xué)參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

取112頭姜曲海豬耳樣組織(均來自姜曲海豬保種場)，用耳號鉗剪一小塊耳組織(約0.5 g)，放入盛有1 ml 70%乙醇的1.5 ml Eppendorf管中，樣品于－20℃保存。選取含有不同組合基因型的試驗(yàn)豬進(jìn)行屠宰，于右半胴體背最長肌中段最后肋與第一、二腰椎間中心部位取樣，測定肉質(zhì)性狀。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 DNA提取 參照文獻(xiàn)［5］按常規(guī)方法提取基因組DNA，將干燥后的DNA溶于100μl TE中，并用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳法檢測DNA的質(zhì)量。1.2.2 PCR擴(kuò)增 參照 GenBank中 FoxO1基因(NM_214014.2)序列，設(shè)計(jì)引物 P1(5'-TGTCATTATGGGGAGGAGAGT-3')、P2(5'-GAGATAAGCAATCCTGAGAAC-3')，PCR產(chǎn)物大小為 337 bp。引物由上海生工公司合成。PCR擴(kuò)增體系(50.0 μl):5× Goldstar PCR buffer 10.0 μl，Goldstar Taq polymerase 2.5 μl，dNTP(2.5 mmol/L)5.0 μl，上、下引物各 2.5μl，模板 DNA 5.0μl，滅菌蒸餾水22.5μl。PCR擴(kuò)增條件:預(yù)變性95℃ 10 min;變性95 ℃ 30 s，退火59℃ 30 s，延伸72℃ 30 s，共35個(gè)循環(huán);最后72℃延伸7 min;4℃保存。

1.2.3 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的酶切 用Bpil酶切337 bp擴(kuò)增產(chǎn)物，酶切體系20.0μl，其中，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物5.0 μl，10 ×Buffer 2.0 μl，限制性內(nèi)切酶 0.5 μl，滅菌蒸餾水12.5μl。37℃反應(yīng)1 h 45 min，95℃ 10 min，酶切產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳分析。

1.2.4 肉質(zhì)性狀的測定 肉色、大理石紋、pH值、系水力和剪切力測定方法參照文獻(xiàn)［6］，肌內(nèi)脂肪含量測定參照文獻(xiàn)［7］，采用索氏抽提法提取肌內(nèi)脂肪。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

1.3.1 基因頻率和基因型頻率的計(jì)算 計(jì)算公式為:Pi=［2(ii)+(ij1)+(ij2)+… +(ijn-1)+(ijn)］/2n，式中，Pi為第 i個(gè)等位基因的頻率，i為純合的復(fù)等位基因，ii為第i個(gè)等位基因純合的個(gè)體數(shù)，jn為與i共顯性的第n個(gè)等位基因，ijn為含有i與jn共顯性等位基因的個(gè)體數(shù)，n為一個(gè)群體內(nèi)個(gè)體的總數(shù)，j1、j2…jn為與i共顯性的第1到第n個(gè)等位基因。由于PCR-RFLP方法的檢測結(jié)果為共顯性等位基因，因此表型頻率即為基因型頻率?；蛐皖l率=基因型個(gè)體數(shù)/測定群體總數(shù)。

1.3.2 基因頻率和基因型頻率的差異顯著性檢驗(yàn)(χ2獨(dú)立性檢驗(yàn)) 首先根據(jù)基因頻率計(jì)算各種基因型頻率的理論值，然后計(jì)算χ2。由于本研究資料的自由度df=1，某些基因型理論值小于5，因此采用矯正公式，式中，Ti為理論值，Ai為實(shí)際觀察值，n為等位基因數(shù)。

1.3.3 FoxO1轉(zhuǎn)錄因子的純合度、雜合度、有效等位基因數(shù)的計(jì)算 純合度計(jì)算公式為式中，H0為某一位點(diǎn)的純合度，Pi為第i個(gè)等位基因的頻率，n為某一位點(diǎn)的等位基因數(shù)。雜合度計(jì)算公式為為某一位點(diǎn)的雜合度，Pi為某一位點(diǎn)上第i個(gè)等位基因頻率，n為某一位點(diǎn)的等位基因數(shù)。有效等位基因數(shù)計(jì)算公式為

1.3.4 FoxO1轉(zhuǎn)錄因子多態(tài)信息含量的計(jì)算 多態(tài)信息含量(PIC)是由Bostein等提出的用于度量群體多態(tài)程度的指標(biāo)，一個(gè)標(biāo)記在群體中的PIC值是根據(jù)其等位基因的頻率來計(jì)算的。其公式為:PIC=1－，式中，n為等位基因數(shù)目，P和iPj分別為第i和第j個(gè)等位基因在群體中的頻率。PIC值用于對標(biāo)記基因多態(tài)性的估計(jì)，PIC＞0.50為高度多態(tài)，PIC＜0.25為低度多態(tài)，0.25≤PIC≤0.50為中度多態(tài)。

1.3.5 FoxO1轉(zhuǎn)錄因子對肌內(nèi)脂肪(IMF)含量的效應(yīng)分析模型 采用固定模型:Yijklm=μ+Ai+Bj+Ck+Dl+Rm+eijklm。式中，Yijklm為IMF含量測量值，μ為群體均值，Ai為場效應(yīng)，Bj為品種效應(yīng)，Ck為年齡效應(yīng)，Dl為性別效應(yīng)，Rm為基因型效應(yīng)，eijklm為隨機(jī)殘差效應(yīng)［8］。由于選擇的試驗(yàn)群體來自同一豬場的同一品種，屠宰年齡接近，所以去掉場效應(yīng)、年齡效應(yīng)和品種效應(yīng)，以上固定模型簡化為Y=μ+Dl+Rm+elm。采用 SPSS13.0軟件包的 GLM(General linear model)過程分析不同F(xiàn)oxO1轉(zhuǎn)錄因子不同基因型對肉質(zhì)性狀的影響。

2 結(jié)果

2.1 姜曲海豬FoxO1基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳結(jié)果

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用2%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，結(jié)果(圖1)顯示，擴(kuò)增片段(337 bp)與目的片段大小一致，且特異性較好，可直接進(jìn)行PCR-RFLP。

圖1 FoxO1基因337 bp的PCR產(chǎn)物Fig.1 PCR product of FoxO1 gene

2.2 FoxO1基因的RFLP結(jié)果

酶切產(chǎn)物中出現(xiàn)3種帶型，酶切產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖譜見圖2。將此酶切位點(diǎn)不存在時(shí)產(chǎn)生的酶切片段類型定義為等位基因E(337 bp)，存在時(shí)產(chǎn)生的酶切片段類型定義為等位基因e(245+92 bp)。

圖2 Bpil酶切337 bp PCR產(chǎn)物的瓊脂凝膠電泳圖譜Fig.2 Agarose gel image of PCR product of FoxO1 digested with Bpil

2.3 試驗(yàn)豬群的Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)檢驗(yàn)

χ2適合性檢驗(yàn)結(jié)果顯示 χ2值為 4.07，小于5.99，表明該群體基因頻率和基因型頻率都處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)(P＞0.05)，主要原因可能是由于該群體在適應(yīng)性方面具有遺傳優(yōu)勢，為長期自然和人工選擇所致。

2.4 FoxO1基因Bpil位點(diǎn)的基因型、基因頻率及遺傳多態(tài)性分析

利用PCR-Bpil-RFLP檢測了姜曲海豬豬群的基因頻率并分析了其遺傳多態(tài)性。結(jié)果顯示:FoxO1基因各基因型在姜曲海豬群中都有分布，在112頭姜曲海豬中有81頭為EE型，25頭為Ee型，6頭為ee型;基因(E)頻率為0.834 8;Bpil位點(diǎn)雜合度(He)為0.275 8，有效等位基因數(shù)(Ne)為1.380 8;姜曲海豬多態(tài)信息含量(PIC)為0.237 8，屬低度多態(tài)(PIC ＜0.25)。

2.5 姜曲海豬FoxO1基因不同酶切基因型對肉質(zhì)性狀的影響

利用SPSS軟件對不同基因型姜曲海豬肉質(zhì)性狀數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果(表1)表明FoxO1基因Bpil位點(diǎn)3種基因型對姜曲海豬的大理石紋、剪切力和肌內(nèi)脂肪含量均有不同程度影響。EE型和Ee型姜曲海豬大理石紋和肌內(nèi)脂肪含量均顯著高于ee型(P＜0.05)，EE型和Ee型之間差異均不顯著(P＞0.05);EE型剪切力顯著低于Ee型和ee型(P＜0.05);肉色、pH值和失水率基因型間無顯著差異。

表1 姜曲海豬FoxO1基因PCR-Bpil-RFLP的3種基因型肉質(zhì)性狀比較Table 1 Comparison of meat quality among three genotypes of FoxO1 gene in Jiangquhai swine

3 討論

豬種基因遺傳多態(tài)性豐富程度與該品種的遺傳基礎(chǔ)有著緊密的聯(lián)系，品種的遺傳基礎(chǔ)越廣泛，其DNA多態(tài)性就越豐富。本研究中，首次檢測了地方品種姜曲海豬FoxO1基因的多態(tài)性。從NCBI中可以知道豬的FoxO1基因定位于11號染色體，含有2個(gè)外顯子和1個(gè)內(nèi)含子，內(nèi)含子片段很長，目前FoxO1基因多態(tài)性研究多集中在人和小鼠方面。Lunetta等采用全基因組關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)在弗明漢人群中FoxO1基因有2個(gè) SNP(單核苷酸多態(tài))［5］。唐媛等研究了中國北方漢族人群FoxO1基因的多態(tài)性［6］。在家畜方面FoxO1基因多態(tài)性的研究很少，王玲等通過測序技術(shù)檢測到FoxO1在肉牛群體中分別存在8個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)［4］。

本試驗(yàn)利用PCR-RFLP檢測了姜曲海豬FoxO1基因多態(tài)性，先將肉質(zhì)差異較大的樣品進(jìn)行克隆測序，初步篩選SNP位點(diǎn)，根據(jù)位點(diǎn)的實(shí)際情況，再選用適宜方法檢測SNP。結(jié)果表明FoxO1基因第1外顯子1 404 bp存在SNP，姜曲海豬FoxO1基因出現(xiàn)了全面的多態(tài)性，基因的各種基因型頻率和基因頻率的χ2檢驗(yàn)結(jié)果顯示，χ2值均小于5.99，表明該群體基因頻率和基因型頻率都處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)(P＞0.05)。姜曲海豬FoxO1基因多態(tài)信息含量為0.237 8，屬低度多態(tài)。一般認(rèn)為，多態(tài)性越高的群體，其遺傳多樣性越豐富。由此可知，姜曲海豬的FoxO1基因遺傳多樣性低，這可能與群體本身的遺傳結(jié)構(gòu)和近年保種有關(guān)。群體的遺傳結(jié)構(gòu)受群體大小、交配系統(tǒng)、祖先群體的多態(tài)性以及遷移、突變和選擇等許多因素的影響。

目前，F(xiàn)oxO基因多態(tài)性與性狀的關(guān)聯(lián)分析報(bào)道主要集中在人類醫(yī)學(xué)研究方面。唐媛等研究了中國北方漢族人群FoxO1基因的多態(tài)性與2型糖尿病易感性的關(guān)聯(lián)性［6］。Lunetta等報(bào)道在弗明漢人群中FoxO1基因的2個(gè)SNP與死亡年齡顯著相關(guān)［5］。黃寧等報(bào)道FoxO1基因與腫瘤、糖尿病及代謝疾病密切相關(guān)［7］。由此可見，F(xiàn)oxO轉(zhuǎn)錄因子功能極其廣泛，主要是由于FoxO轉(zhuǎn)錄因子能夠調(diào)節(jié)PI3K/AKT或PI3K/PKB信號通路中的下游基因，而這些基因與細(xì)胞生理過程相關(guān)，如細(xì)胞凋亡、DNA損傷/修復(fù)、應(yīng)激等，此外FoxO轉(zhuǎn)錄因子在脂肪分化、肌肉生成等過程中也發(fā)揮著關(guān)鍵作用。張輝等以C2C12成肌細(xì)胞為模型，研究發(fā)現(xiàn)過表達(dá)FoxO1能誘導(dǎo)Ⅰ型肌纖維向Ⅱ型肌纖維轉(zhuǎn)化，并顯著降低鈣調(diào)磷酸酶活力［8］。由此我們推斷豬FoxO基因可能也影響豬的多方面機(jī)能。

本試驗(yàn)研究了豬FoxO1基因遺傳多態(tài)性與肉質(zhì)性狀的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)姜曲海豬FoxO1基因不同基因型間大理石紋、剪切力和肌內(nèi)脂肪含量均有不同程度差異。FoxO1基因PCR-Bpil-RFLP的3種基因型中，EE型和Ee型的大理石紋和肌內(nèi)脂肪含量顯著高于ee型，這可能與FoxO1基因間接參與脂肪代謝有關(guān)。張野等采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，對不同月齡民豬和長白豬腎周脂肪中FoxO1、過氧化物酶體增殖物激活受體(PPARγ)和CAAT區(qū)/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白α(C/EBPα)基因 mRNA表達(dá)量進(jìn)行檢測，結(jié)果表明FoxO1基因可能通過抑制PPARγ和C/EBPα這2個(gè)基因的表達(dá)來減少脂肪沉積［9］。史新娥等報(bào)道FoxO1轉(zhuǎn)錄因子去磷酸化可以抑制豬前體脂肪細(xì)胞分化［10］。

鑒于豬FoxO1基因遺傳多態(tài)性與肉質(zhì)性狀存在相關(guān)性，可以推斷，在骨骼肌生長發(fā)育中，F(xiàn)oxO扮演了重要角色。其主要原因是由于FoxO轉(zhuǎn)錄因子廣泛參與生理代謝［11］。祁樣正報(bào)道FoxO基因表達(dá)量會隨著肌肉生長分化有所增長，而FoxO1在肌肉分化過程中，表達(dá)量一直保持較高，而且變化不明顯，這可能與其重要的功能有關(guān)［12］。楊燕軍等報(bào)道FoxO1與Ⅰ型和Ⅱb型肌纖維基因的表達(dá)密切相關(guān)[13]。

在本研究中，由于試驗(yàn)條件的限制，樣本數(shù)目有限，這在一定程度上影響了遺傳效應(yīng)分析的準(zhǔn)確性。在今后的研究中應(yīng)擴(kuò)大樣本含量，在更多的群體中進(jìn)行分析，以深入研究FoxO家族基因?qū)∪夂椭拘誀钏鸬淖饔茫业接行У姆肿訕?biāo)記應(yīng)用于標(biāo)記輔助選擇育種。

［1］ BRUNET A，TRAN H，GREENBERG M E.FoxO transcription factors:key targets of the PI3K-Akt pathway that regulate cell proliferation，survival，and organismal aging［J］.Regulation of Organelle and Cell Compartment Signaling:Cell Signaling Collection，2011，6:43-56.

［2］ SEILER F，HELLBERG J，LEPPER P M，et al.FoxO transcription factors regulate innate immune functions in respiratory epithelial cells［J］.Pneumologie，2012，66(11):1-11.

［3］ GUO Y，LI J，SHANG J，et al.Development of muscle-related genes and their effects on meat quality［J］.Energy Procedia，2012，16:229-233.

［4］ 王 玲.普通牛FoxO1、FoxO3、FoxO4基因的克隆、表達(dá)及其對肉質(zhì)性狀的遺傳效應(yīng)分析［D］.成都:四川農(nóng)業(yè)大學(xué)，2010.

［5］ LUNETTA K L，DAGOSTINO R B，KARASIK D，et al.Genetic correlates of longevity and selected age-related phenotypes:a genome-wide association study in the Framingham study［J］.BMC Med Genet Suppl，2007，l:13-15.

［6］ 唐 媛，程 熠，喬乙春，等.FoxO1基因多態(tài)性與2型糖尿病易感性的關(guān)聯(lián)性分析［J］.吉林大學(xué)學(xué)報(bào)，2013，39(1):87-91.

［7］ 黃 寧，李文佳，安利國，等.FoxO1的功能及其與人類疾病的關(guān)系［J］.生命科學(xué)，2012(4):334-339.

［8］ 張 輝，史新娥，袁 媛，等.FoxO1抑制豬骨骼肌MyHCL的表達(dá)［J］.中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào)，2010，26(3):283-289.

［9］ 張 野，崔世泉，狄生偉，等.叉頭框轉(zhuǎn)錄因子O亞族1基因?qū)ωi腎周脂肪沉積代謝的影響［J］.中國畜牧獸醫(yī)，2013，40(2):117-120.

［10］史新娥，宋子儀，楊 浩，等.叉頭框轉(zhuǎn)錄因子 O亞族1(FoxO1)去磷酸化抑制豬前體脂肪細(xì)胞分化［J］.農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2011，19(5):837-842.

［11］ WANG Y X，WANG T.Regulatory roles of FoxO transcription factors in metabolism［J］.JAnim Sci Biotech，2011，2:179-184.

［12］祁樣正.FOXOs轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子家族對肌肉細(xì)胞末期分化的影響［D］.臺灣:國立中央大學(xué)，2006.

［13］楊燕軍，龐衛(wèi)軍，白 亮，等.八眉豬、長白豬和長×八雜交豬肌肉組織中 FoxO1基因的表達(dá)［J］.遺傳，2008，30(2):185-189.