李漢全， 張炳火， 楊建遠(yuǎn)， 查代明， 過七根， 石 翔， 郭 靜

(九江學(xué)院藥學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，江西 九江 332000)

藍(lán)藻水華是世界性的水污染問題，暴發(fā)時(shí)產(chǎn)生大量藍(lán)藻毒素，造成嚴(yán)重的環(huán)境問題［1-4］，威脅人類健康 ，給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失 。隨著全球氣候變暖、富營養(yǎng)化加劇，藍(lán)藻水華發(fā)生頻率日益增加，水華水體藻毒素濃度也越來越高［8］。雖然目前有物理、化學(xué)和生物操縱等多種水華防治方法，但這些方法具有諸多缺點(diǎn)，如成本高、容易造成二次污染，選擇毒性差或者只能適應(yīng)小面積水域［9-13］。因此，迫切需要尋找新型、高效、環(huán)保的藍(lán)藻水華防治方法。

研究結(jié)果表明，環(huán)境中存在大量的抑藻放線菌，這些放線菌可分泌許多抑藻活性成分，殺死藻細(xì)胞，諸如賴氨酸［14］、鏈霉素［15，16］、niromycin A［17］、anthracidin A［18］、萬古霉素、D-環(huán)絲氨酸、新生霉素［19］、七 尾 霉 素 A 甲 酯［20］和 2-hydroxy-12-oleanene-3，28-O-D-glucopyranosyl［21］等，其中部分化合物對水華藍(lán)藻選擇毒性好，如賴氨酸對微囊藻具有抑藻活性，但是對硅藻和綠藻卻沒有毒性［22］。因此，抑藻放線菌及其代謝產(chǎn)物在水華藍(lán)藻防治中具有重要的潛在應(yīng)用價(jià)值。

銅綠微囊藻(Microcystis aeruginosa)是引起水華的最常見藻種［23-24］，是微囊藻毒素的主要產(chǎn)生者［25］，也是中國藍(lán)藻水華的主要藻種。本研究以銅綠微囊藻FACHB-905為指示藻，篩選抑藻放線菌，并初步研究其對銅綠微囊藻的抑藻活性及其部分影響因素。

1 材料與方法

1.1 指示藻

銅綠微囊藻(M.aeruginosa FACHB-905)，購自中國科學(xué)院水生生物研究所淡水藻種庫，并利用平板劃線法進(jìn)行純化，獲得無菌藻株。藻種在25℃、30～50μmol/(m2·s)、光暗比為12 h∶12 h的條件下靜置培養(yǎng)，每天搖動(dòng)4次，每次30 s左右，藻培養(yǎng)基為HGZ培養(yǎng)基。藻平板制作參照文獻(xiàn)［26］進(jìn)行。

HGZ液體培養(yǎng)基:NaNO3496.0 mg，KH2PO439.0 mg，MgSO4·7H2O 75.0 mg，CaCl2·2H2O 36.0 mg，Na2SiO3·9H2O 58.0 mg，土壤提取液 3.0 ml，金屬鹽溶液3.0 ml(Na2-EDTA 75.0 mg，F(xiàn)eCl3·6H2O 9.7 mg，MnCl2· 4H2O 4.1 mg，ZnCl20.5 mg，CoCl2·6H2O 0.2 mg，Na2MoO4·2H2O 0.4 mg，蒸餾水100.0 ml)，蒸餾水 994.0 ml，pH 8.0 ～8.5。

1.2 抑藻放線菌的篩選及形態(tài)鑒定和16SrRNA系統(tǒng)發(fā)育分析

采用點(diǎn)接法，將土壤中分離的放線菌接種于YIM 38固體平板培養(yǎng)基 ，28℃下培養(yǎng)4～7 d后，用無菌打孔器將長有菌落的瓊脂塊取出并置于藻平板上，按照方法1.1的條件培養(yǎng)，3 d后觀察抑藻圈的產(chǎn)生情況，并根據(jù)抑藻圈的有無判斷菌株是否產(chǎn)生抑藻活性物質(zhì)。

參照文獻(xiàn)［27］對菌株的形態(tài)進(jìn)行鑒定以及對16SrRNA基因序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析。采用埋片法制備放線菌菌絲樣本，利用掃描電鏡觀察菌絲形態(tài)。采用溶菌酶法提取基因組DNA，用細(xì)菌通用引物primer A(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')和primer B(5'-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3')進(jìn)行PCR擴(kuò)增，檢測序列，并將其16SrRNA基因序列在GenBank核酸序列數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行序列同源性比較，通過CLUSTALX和MEGA軟件進(jìn)行序列比對分析，并以Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3 菌株JXJ 0089液體培養(yǎng)時(shí)間

將生長良好的斜面菌種接入YIM 38#液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)48 h后，按照10%(體積比)的接種量接入無菌液體培養(yǎng)基(組成:葡萄糖15.0 g，大豆粉15.0 g，酵母浸粉2.0 g，淀粉 10.0 g，蛋白胨 2.0 g，麥芽浸粉 2.0 g，NaCl 4.0 g，K2HPO40.4 g，MgSO4·7 H2O 0.5 g，Ca-CO32.0 g，H2O 1 000 ml，pH7.8)，于 180 r/min、28℃搖床培養(yǎng)，每24 h取樣1次，連續(xù)取樣13次，培養(yǎng)液在4 500 r/min的條件下離心10 min，上清液置于無菌容器中，于4℃冰箱保藏備用。取2%(體積比)的上清液加入銅綠微囊藻藻液(5×106CFU/ml)中，采用方法1.1的培養(yǎng)條件進(jìn)行培養(yǎng)，3 d后采用熱乙醇法測藻液的葉綠素 a(Chl.a)含量［28］，并根據(jù)抑藻效率(%)=(1－Ct/Cc)×100%(Cc和Ct分別為對照組和試驗(yàn)組Chl.a的濃度)計(jì)算抑藻效率，根據(jù)各樣品抑藻效率確定發(fā)酵時(shí)間。

1.4 上清液抑藻活性組分分析

將放線菌培養(yǎng)液的上清液進(jìn)行真空冷凍干燥，干燥物分別用乙酸乙酯、甲醇和去離子水溶解，減壓蒸餾除去各樣品溶液的溶劑后稱質(zhì)量，再將各樣品配制為2μg/μl的溶液，用移液器取20μl溶液于無菌濾紙片(直徑為0.6 cm)上，置于無菌培養(yǎng)皿中，待溶劑完全揮發(fā)后將濾紙片再置于藻平板上，按照方法1.1中的方法培養(yǎng)1～3 d后，用游標(biāo)卡尺測量抑藻圈直徑，根據(jù)抑藻圈直徑判斷樣品抑藻活性強(qiáng)弱，并利用薄層層析(TLC)硅膠板進(jìn)行分析，利用Anis顯色劑［29］和茚三酮顯色劑顯色。

1.5 菌株JXJ 0089的孢子、菌絲體和藻液之間的相互影響

1.5.1 菌株JXJ 0089孢子與銅綠微囊和藻之間的相互影響 取純化的無菌藻和未純化的有菌藻各100 ml(5×106CFU/ml)，分別加入2 ml放線菌孢子懸液(1.0×107CFU/ml)，8 d后檢測抑藻效率。并用顯微鏡觀察藻液中是否存在放線菌菌絲體，并取0.1 ml藻液涂布于YIM 38#固體平板上，28℃下培養(yǎng)，連續(xù)觀察7 d，記錄放線菌和細(xì)菌的生長情況。對照組試驗(yàn)藻液加入2 ml無菌水。

1.5.2 菌株JXJ 0089菌絲體與銅綠微囊藻之間的相互影響 分別取 0 g、0.15 g、0.30 g、0.45 g和0.60 g菌絲體(濕質(zhì)量)，加入 100 ml(5×106CFU/ml)無菌藻和有菌藻中，8 d后測抑藻效率。用顯微鏡觀察藻液中放線菌的菌絲形態(tài)，并取0.1 ml藻液涂布于YIM 38#固體平板上，于28℃下培養(yǎng)，連續(xù)觀察7 d，記錄放線菌和細(xì)菌生長情況。

1.6 藻液中抑制放線菌JXJ 0089的細(xì)菌

采用平板劃線法，對藻液中的細(xì)菌進(jìn)行分離純化，在獲得純培養(yǎng)細(xì)菌后，再將其點(diǎn)接于涂布有放線菌JXJ 0089孢子的平板培養(yǎng)基上，培養(yǎng)3 d后觀察細(xì)菌菌落周圍是否出現(xiàn)抑菌圈。提取有拮抗活性的細(xì)菌的基因組，對其16S rRNA基因序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 抑藻放線菌的篩選及形態(tài)鑒定和16SrRNA系統(tǒng)發(fā)育分析

試驗(yàn)結(jié)果顯示，對照組YIM 38#培養(yǎng)基在藻平板上未產(chǎn)生明顯抑藻圈，而用于篩選的160株放線菌中，35株能夠在藻平板上形成明顯的抑藻圈，其中放線菌JXJ 0089形成的抑藻圈較透明，這說明該菌產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物抑藻活性較強(qiáng)，或者活性成分的含量較高，因此選為后續(xù)研究菌株。

放線菌JXJ 0089在固體平板上生長初期氣絲相對較少，但隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，氣絲變得極為發(fā)達(dá)，灰白色，基絲灰褐色，產(chǎn)生水溶性黃褐色色素，孢子絲與 S.eurocidicus［30］類似，為典型鏈狀輪生，孢子橢圓形，表面光滑(圖1)。16S rRNA基因序列(1 529 bp;GenBank登錄號:KP193140)分析結(jié)果表明，放線菌JXJ 0089屬于鏈霉菌屬(Streptomyces)的成員，與S.eurocidicus NRRL B-1676T親緣關(guān)系最近(99.73%)，采用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，該菌和S.eurocidicus NRRL B-1676T聚在單獨(dú)的一支上(圖2)。結(jié)合形態(tài)特征，將放線菌 JXJ 0089鑒定為Streptomyces eurocidicus JXJ 0089。

圖1 菌株JXJ 0089在YIM 38#培養(yǎng)基上28℃培養(yǎng)14 d后孢子絲的掃描電鏡照片F(xiàn)ig.1 Scanning electron micrograph of spore chains of S.eurocidicus JXJ 0089 after growth on YIM 38#medium at 28℃for 14 d

2.2 菌株JXJ 0089培養(yǎng)時(shí)間

由圖3可知，菌株JXJ 0089在28℃、180 r/min的條件下培養(yǎng)11 d后，其上清液抑藻效率為88.02% ±1.63%，此后變化不明顯，因此確定發(fā)酵時(shí)間為12 d。

2.3 上清液抑藻活性組分分析

抑藻活性組分分析結(jié)果顯示，乙酸乙酯溶解的組分抑藻活性較弱，抑藻圈直徑為8.92 mm，甲醇溶解的組分抑藻活性較強(qiáng)，抑藻圈直徑為13.65 mm，去離子水溶解的組分，抑藻活性最強(qiáng)，抑藻圈直徑為16.73 mm，這說明該菌產(chǎn)生多種抑藻活性物質(zhì)。TLC檢測和顯色劑顯示結(jié)果表明，乙酸乙酯和甲醇溶解部分的代謝產(chǎn)物化學(xué)多樣性豐富，而水溶性成分茚三酮顯色明顯，主要為含氨基的化合物。

2.4 放線菌的孢子、菌絲體與銅綠微囊藻之間的相互影響

2.4.1 孢子與銅綠微囊藻之間的相互影響 抑藻活性分析結(jié)果顯示，放線菌JXJ 0089的孢子對無細(xì)菌藻的抑藻效率為2.17% ±4.06%，對有細(xì)菌藻的抑藻效率為6.53% ±3.88%，兩種情況下的抑藻效率沒有顯著差異(P＞0.05)，與對照組相比，其Chl.a含量也均無顯著差異(P＞0.05)。顯微鏡觀察結(jié)果顯示，在無細(xì)菌藻液和有細(xì)菌藻液中，孢子均未萌發(fā)。涂布培養(yǎng)結(jié)果顯示，加入放線菌孢子的無細(xì)菌藻液涂布培養(yǎng)1～2 d后，平板上即長出大量放線菌菌落，但加入放線菌孢子的有細(xì)菌藻液涂布培養(yǎng)7 d后，平板上仍然未長出放線菌菌落，這說明，無細(xì)菌藻液中的放線菌孢子的萌發(fā)雖然受到藻液抑制，但并未死亡，因此涂布在固體培養(yǎng)基上能夠迅速萌發(fā)生長;而在有細(xì)菌藻液中的放線菌孢子已經(jīng)死亡，因此涂布在固體培養(yǎng)基上長時(shí)間培養(yǎng)后仍未見萌發(fā)生長。

圖2 菌株JXJ 0089及親緣關(guān)系最近的相關(guān)種以鄰接法構(gòu)建的16S r RNA基因系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.2 Phylogenotic tree of strain JXJ 0089 and other related species of Streptomyces based on 16Sr RNA gene sequences by neighbour-joining

圖3 培養(yǎng)時(shí)間對S.eurocidicus JXJ 0089抑藻活性的影響Fig.3 Influence of culture time on the inhibitory activity of S.eurocidicus JXJ 0089

2.4.2 菌絲體與銅綠微囊藻之間的相互影響 由圖4可知，在100 ml藻液中加入0.2 g菌絲體培養(yǎng)8 d后，有細(xì)菌藻和無細(xì)菌藻中Chl.a的去除率分別為 52.51% ±2.02%和66.89% ±2.34%，但隨著菌絲體的繼續(xù)增加，Chl.a的去除率沒有大幅度增加，即使菌絲體增加到0.8 g，有細(xì)菌藻和無細(xì)菌藻中Chl.a的去除率也僅分別為 59.00% ±1.98%和76.35% ±1.55%。在藻細(xì)胞初始濃度相同的情況下，菌株JXJ 0089菌絲體對無細(xì)菌藻Chl.a的去除率顯著高于有細(xì)菌藻(P＜0.01)。顯微鏡觀察顯示，無論是在有細(xì)菌藻中還是在無細(xì)菌藻中，放線菌JXJ 0089的菌絲形態(tài)沒有明顯變化。但平板涂布培養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)果顯示，加入放線菌菌絲的無細(xì)菌藻液涂布培養(yǎng)1～2 d后，即長出大量放線菌菌落，而加入放線菌菌絲的有菌藻液涂布培養(yǎng)7 d后，仍然未見放線菌長出，這說明，在無細(xì)菌藻液中的放線菌菌絲體未死亡，而在有細(xì)菌藻液中的放線菌菌絲體已經(jīng)死亡。

圖4 放線菌JXJ 0089的菌絲體對有細(xì)菌藻和無細(xì)菌藻葉綠素a(Chl.a)的去除率Fig.4 The removal rates of Chl.a in the impure and pure culture of M.aeruginosa by the mycelia of actinomycete strain JXJ 0089

2.5 藻液中抑制放線菌的細(xì)菌

經(jīng)平板劃線，從M.aeruginosa FACHB-905培養(yǎng)液中純化到19株細(xì)菌，抑菌試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，4株細(xì)菌(編號分別為 CY-7、CY-12、CY-16和 CY-19)的菌落周圍出現(xiàn)明顯的抑菌圈，表明它們對放線菌JXJ 0089具有抑制作用。16SrRNA基因序列分析結(jié)果表明，細(xì)菌 CY-7與Sphingomonas koreensis JSS26T親緣關(guān)系最近，序列相似性為98.42%，在系統(tǒng)進(jìn)化樹上它們聚在一支(圖5A);細(xì)菌 CY-12(1 420 bp)與Pseudomonas azotoformans IAM1603T親緣關(guān)系最近，為99.72%，在系統(tǒng)進(jìn)化樹上它們聚在一支(圖5B);細(xì)菌 CY-16(1 410 bp)與 Agrococcus terreus DNG5T的親緣關(guān)系最近，為99.72%，在系統(tǒng)進(jìn)化樹上它們聚在一支(圖5C);細(xì)菌CY-19(1 541 bp)與Modestobacter marinus 42H12-1T的親緣關(guān)系最近，為99.12%，在系統(tǒng)進(jìn)化樹上它們聚在一支(圖5D)。這些細(xì)菌產(chǎn)生何種物質(zhì)抑制抑藻放線菌JXJ 0089，以及這些細(xì)菌對銅綠微囊藻的生長有何影響，目前正在進(jìn)一步研究中。

3 討論

抑藻放線菌廣泛存在于水陸環(huán)境中，且對水華藍(lán)藻具有抑制作用的菌株比率很高［14，31］，這與本研究結(jié)果一致。目前發(fā)現(xiàn)的抑制藍(lán)藻的放線菌主要為鏈霉菌，如 S.achromogenes［32］、S.phaeofaciens［14］、S. jiujiangensis［33］、S. lushanensis［34］、S. exfoliates［35］、S.endus［17］、S.neyagawaensis［18，36］和 S.hebeiensis 等，本研究首次報(bào)道鏈霉菌S.eurocidicus對藍(lán)藻有抑制活性。

S.eurocidicus代謝產(chǎn)物豐富，能夠產(chǎn)生多種抗生素，如叔霉素、氮霉素、優(yōu)洛殺菌素［37］，但尚未有文獻(xiàn)報(bào)道這些抗生素有抑藻活性。本研究發(fā)現(xiàn)，S.eurocidicus JXJ 0089能夠分泌多種極性不同的活性成分，抑制銅綠微囊藻生長，其中水溶性成分主要是氨基類化合物。鏈霉菌產(chǎn)生的含氨基的抑藻物質(zhì)有蛋白質(zhì)［36］和賴氨酸［14］，另外，含有賴氨酸的多肽往往也具有抑藻活性［38］。TLC分析和茚三酮顯色結(jié)果說明，S.eurocidicus JXJ 0089產(chǎn)生的水溶性氨基類化合物極性比賴氨酸小，顯色也不同，因此應(yīng)該是其他含氨基的化合物。

放線菌的孢子在無細(xì)菌銅綠微囊藻藻液中不能萌發(fā)生長，但并未死亡，其菌絲體在無細(xì)菌藻液中也能存活，這說明藻細(xì)胞或其產(chǎn)生的藻毒素等代謝產(chǎn)物，雖然對放線菌具有一定的抑制作用，尤其是抑制其孢子萌發(fā)，但對放線菌的孢子或菌絲體均沒有明顯的致死作用。

藍(lán)藻附生細(xì)菌對藍(lán)藻的生長有重要影響，它們的生理活動(dòng)或部分代謝產(chǎn)物對藻細(xì)胞的生長有促進(jìn)作用［39］。我們發(fā)現(xiàn)，在藻細(xì)胞起始濃度相同 (5×106CFU/ml)的情況下，有細(xì)菌藻生長速率顯著高于無細(xì)菌藻，8 d后葉綠素 a含量達(dá)到 (1.111±0.042)mg/L，比無細(xì)菌藻 (0.688 ±0.051)mg/L高(P＜0.01)，這可能是附生細(xì)菌通過其生理代謝活動(dòng)，降低了對藻細(xì)胞有害物質(zhì)的濃度，改善了藻細(xì)胞的生長環(huán)境，或者為藻細(xì)胞提供了一些生長所需要的營養(yǎng)成分，從而促進(jìn)了藻細(xì)胞的生長，這應(yīng)該是S.eurocidicus JXJ 0089菌絲體對無細(xì)菌藻的抑藻效率顯著高于有細(xì)菌藻的重要原因之一。

微囊藻附生細(xì)菌包括α-Proteobacteria、γ-Proteobacteria、Actinobacteria和 Bacteroidetes等，其中α-Proteobacteria、γ-Proteobacteria 是 其 主 要 類群［40-44］。從 M.aeruginosa FACHB-905藻液中分離的4株對S.eurocidicus JXJ 0089有抑制作用的細(xì)菌，其中CY-7屬于α-Proteobacteria的鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)，CY-12 屬于γ-Proteobacteria的假單胞菌屬(Pseudomonas)，而CY-16和CY-19分別屬于Actinobacteria的土壤球菌屬(Agrococcus)和貧養(yǎng)桿菌屬(Modestobacter)，Sphingomonas和 Pseudomonas是目前研究最多的兩類微囊藻附生細(xì)菌。微囊藻的存在有利于附生細(xì)菌的生存，增強(qiáng)了細(xì)菌吸附有機(jī)物等各種營養(yǎng)物質(zhì)的能力，為細(xì)菌提供了有機(jī)碳源和更為安全的生長環(huán)境［39］。因此，附生細(xì)菌可能會(huì)抑制一些對藻細(xì)胞有害的微生物，降解其抑藻物質(zhì)，保護(hù)藻細(xì)胞，以達(dá)到維護(hù)自身良好生存環(huán)境條件的目的，這可能是S.eurocidicus JXJ 0089菌絲體對無細(xì)菌藻的抑藻效率顯著高于有細(xì)菌藻的另一個(gè)重要原因。這些研究結(jié)果表明，利用抑藻微生物防治藍(lán)藻水華，必須充分考慮藻細(xì)胞的附生細(xì)菌在其中的作用。

圖5 銅綠微囊藻附生細(xì)菌及相關(guān)種以鄰接法構(gòu)建的16S r RNA基因系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.5 Phylogenetic tree of attached bacteria species of M.aeruginosa based on 16S r RNA gene sequences by neighbor-joining

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