葉 錦， 張靜茹， 覃益民， 劉幽燕

(廣西大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，廣西 南寧 530004)

纖維素是葡萄糖以β-1，4糖苷鍵組成的大分子多糖，是最豐富的天然可再生生物資源［1-3］。纖維素可通過纖維素酶水解轉(zhuǎn)化為可發(fā)酵性糖，繼而轉(zhuǎn)化為燃料乙醇及相關(guān)化學(xué)品［4］。

纖維素酶是多組分酶系，主要由內(nèi)切β-葡聚糖苷酶(EG)、外切 β-葡聚糖苷酶(CBH)和 β-葡萄糖苷酶3個(gè)主要成分組成［5］。盡管大量研究結(jié)果已表明，只有在這3個(gè)主要成分酶的協(xié)同作用下，纖維素分子最終才能被降解成葡萄糖。但由于纖維素酶的多樣性及不易分離純化，致使人們對(duì)纖維素酶的結(jié)構(gòu)、功能，特別是降解纖維素的作用機(jī)制還缺乏足夠的了解，對(duì)纖維素酶各成分是如何協(xié)同起作用的，學(xué)者們的看法還不盡相同［6］，近年來人們還發(fā)現(xiàn)了一些不具有纖維素酶活性的蛋白質(zhì)也能與纖維素酶起協(xié)同作用，并最終能促進(jìn)纖維素的降解［7-8］。因此，開展對(duì)相關(guān)纖維素酶組分的分離純化及其酶學(xué)性質(zhì)研究，無論是對(duì)纖維素酶系各成分酶的協(xié)同作用機(jī)理還是對(duì)纖維素酶系與其他非酶蛋白質(zhì)的協(xié)同增效作用的更深入了解，都將提供重要的方法和理論基礎(chǔ)。

康氏木霉GIMP3.444是1株產(chǎn)纖維素酶系的真菌菌株，覃益民等最近從該菌株中分離純化出一種纖維素酶協(xié)同增效蛋白質(zhì)［9］。本研究對(duì)康氏木霉GIMP 3.444菌株產(chǎn)的纖維素酶系各組分酶進(jìn)行分離純化，并對(duì)其中1種內(nèi)切β-葡聚糖苷酶酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行研究，為纖維素酶的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌種與培養(yǎng)條件

康氏木霉(Trichodermakoningii)GIMP3.444購(gòu)于廣東省微生物菌種保藏中心，現(xiàn)保藏于廣西大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院生物化工實(shí)驗(yàn)室。

斜面活化培養(yǎng)基:馬鈴薯200.0 g、葡萄糖20.0 g、KH2PO43.0 g、MgSO4·7H2O 1.5 g 、瓊脂粉 20.0 g，加自來水至1 000 ml，調(diào) pH 6.0，121 ℃ 滅菌 20 min。

搖瓶種子培養(yǎng)基:馬鈴薯200.0 g、葡萄糖20.0 g、KH2PO43.0 g、MgSO4·7H2O 1.5 g，加自來水至1 000 ml，調(diào) pH 6.0，121 ℃滅菌20 min。

液體發(fā)酵培養(yǎng)基:甘蔗渣(過80目篩)15.0 g、麥麩粉 8.0 g、(NH4)2SO44.0 g、KH2PO43.0 g、MgSO4·7H2O 1.5 g，加自來水至1 000 ml，調(diào) pH 6.0，121 ℃滅菌 20 min。

取保藏的康氏木霉接種于斜面活化培養(yǎng)基，28℃條件下活化培養(yǎng)3～7 d，刮取平面孢子，用無菌水制成孢子懸浮液，按1%(體積比)接種至種子培養(yǎng)液中，于180 r/min、28℃下培養(yǎng)30～36 h。將搖瓶種子按5%(體積比)接種量接種至裝有150 ml發(fā)酵培養(yǎng)基的500 ml三角瓶中，于180 r/min、28℃下培養(yǎng)120 h。

1.2 粗酶的預(yù)處理

發(fā)酵液在4℃，8 000 r/min下離心20min，收集上清液，經(jīng)過10 000濾膜壓濾，將濾液用超濾膜濃縮，得到粗酶液。粗酶液用20%飽和度的硫酸銨沉淀，4℃下靜置過夜后，于8 000 r/min離心20 min，取上清液繼續(xù)加入硫酸銨至飽和度為85%，4℃下靜置過夜，離心棄上清液，收集沉淀，加入少量0.1 mol/L pH 8.0的Tris-HCl緩沖液復(fù)溶，再次離心除去不溶的雜質(zhì)，濃縮酶液于4℃下充分透析后保存。

1.3 纖維素酶的純化

1.3.1 DEAE Sepharose FF離子交換層析 粗酶液先用DEAE Sepharose FF離子交換層析法進(jìn)行初步分離，分離柱規(guī)格為 1.6 cm×40.0 cm，用 NaCl濃度梯度從 0 mol/L到 0.8 mol/L的 Tris-HCl(0.1 mol/L、pH 8.0)緩沖液分步洗脫收集，測(cè)定各峰纖維素內(nèi)切酶活力，收集有酶活力的峰，4℃保存。所有的操作都在4℃下進(jìn)行。

1.3.2 Sephadex G-75凝膠過濾層析 用G75凝膠過濾層析法進(jìn)一步分離DEAE Sepharose FF離子交換層析得到的目標(biāo)峰，采用 AKTA pure層析系統(tǒng)，用pH 4.8、0.1 mol/L檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液洗脫，收集每個(gè)峰，測(cè)定內(nèi)切β-葡聚糖酶活力，收集有酶活力的洗脫峰，4℃保存。所有的操作都在4℃下進(jìn)行。

1.4 測(cè)定方法

1.4.1 蛋白質(zhì)濃度的測(cè)定［10］以牛血清白蛋白質(zhì)為標(biāo)準(zhǔn)，用考馬斯亮藍(lán)G-250法測(cè)蛋白質(zhì)濃度。

1.4.2 內(nèi)切 β-葡聚糖苷酶活力測(cè)定 采用3，5-二硝基水楊酸(DNS)法測(cè)定內(nèi)切酶活性［11］。向試管中各加入1.5 ml 1%(質(zhì)量體積比)的羧甲基纖維素鈉檸檬酸-檸檬酸鈉溶液(0.1 mol/L，pH 4.8)及0.5 ml酶液，在50℃水浴中保溫30 min，取出后，加入3.0 ml DNS試劑終止反應(yīng)，再沸水浴5 min后，取出流水冷卻，定容至25 ml，在540 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。以1 ml酶液每30 min催化底物產(chǎn)生出相當(dāng)于1 mg葡萄糖的還原糖量為1個(gè)酶活力單位，以U/ml表示。

1.4.3 蛋白質(zhì)純度鑒定及相對(duì)分子量測(cè)定 采用SDS-PAGE法測(cè)定蛋白質(zhì)純度。聚丙烯酰胺凝膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)12%，蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品的相對(duì)分子質(zhì)量范圍14 400～97 400。

1.5 MALDI-TOFMS分析

蛋白質(zhì)的鑒定和肽段分析采用MALDI-TOFMS方法［12］。將目標(biāo)電泳條帶切下，37℃用胰蛋白酶處理過夜后，將生物大分子電離后檢測(cè)。肽段的信息在NCBInr數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索。

1.6 最適pH值和溫度

最適反應(yīng)pH值:取純酶液在 pH 3.0～7.5條件下(pH 3.0～6.0為檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液、pH 6.5～7.5為磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液)，50℃保溫30 min，分別測(cè)定內(nèi)切β-葡聚糖苷酶活力，確定酶的最適反應(yīng)pH值。

最適反應(yīng)溫度:取純酶液在溫度35～70℃條件下，pH4.8保溫30 min，分別測(cè)定內(nèi)切β-葡聚糖苷酶活力，確定酶的最適反應(yīng)溫度。

1.7 底物動(dòng)力學(xué)參數(shù)測(cè)定

分別配制濃度為 0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.7%、1.0%、1.5%、2.0%和2.5%的羧甲基纖維素鈉懸浮液(pH 4.8)，與內(nèi)切酶在50℃水浴中保溫30 min，DNS法測(cè)定不同濃度底物產(chǎn)生的還原糖，然后按照Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖法作圖，得出該酶作用于羧甲基纖維素鈉時(shí)的 Km值。

1.8 金屬離子對(duì)酶活性的影響

取不同的金屬離子0.3 mmol/L與纖維素酶在pH 4.8的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液，在30℃水浴保溫30 min后，50℃下反應(yīng)30 min，測(cè)量有金屬離子作用下的酶活性，以不加金屬離子的酶活性為100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 酶的分離純化

將20%～85%硫酸銨沉淀和透析后獲得的粗蛋白質(zhì)經(jīng)DEAE Sepharose FF離子交換層析后，出現(xiàn)5個(gè)峰(圖1)。經(jīng)測(cè)定，峰2和峰3均有內(nèi)切β-葡聚糖苷酶活力，其中峰3內(nèi)切β-葡聚糖苷酶比活力較高，這說明康氏木霉的發(fā)酵液中至少含有2種內(nèi)切β-葡聚糖苷酶。

將離子交換層析得到的蛋白質(zhì)峰3經(jīng)過Sephadex G-75凝膠過濾層析，得到5個(gè)峰(圖2)。經(jīng)測(cè)定，峰3-4為主要的內(nèi)切酶組分。

圖1 總蛋白質(zhì)DEAE sepharose FF離子交換層析洗脫曲線Fig.1 Elution profile of the total protein on DEAE sepharose FF

圖2 Sephadex-G75凝膠過濾層析曲線Fig.2 Filtration profile of peak 3 of the protein on sephadex-G75

內(nèi)切β-葡聚糖苷酶的整個(gè)分離純化過程結(jié)果如表1。最終得到的這種內(nèi)切酶組分比活力達(dá)到19.65 U/mg，與粗酶液相比，提高了3.65倍，回收率為2.83%。

2.2 內(nèi)切β-葡聚糖苷酶純度、分子量測(cè)定及其蛋白質(zhì)種類鑒定

純化的內(nèi)切β-葡聚糖苷酶組分經(jīng)SDS-PAGE電泳，發(fā)現(xiàn)只有1條帶(圖3)，表明該組分已達(dá)電泳純。經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)分析，該酶的相對(duì)分子量約為44 600。

表1 內(nèi)切β-葡聚糖苷酶的純化結(jié)果Table 1 Purification of endo-β-glucanase

圖3 內(nèi)切β-葡聚糖苷酶SDS-PAGE電泳圖譜Fig.3 Identification of endo-β-glucanase by SDS-PAGE

將該酶進(jìn)行質(zhì)譜分析和數(shù)據(jù)庫(kù)檢索，只有當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)得分大于65和得分可信度大于95%時(shí)，才能說明2種蛋白質(zhì)可能匹配。但從質(zhì)譜結(jié)果發(fā)現(xiàn)Mascot得分最高的前5個(gè)蛋白質(zhì)得分也分別只有 62、59、55、55、55 分，得分可信度都為 0。兩項(xiàng)數(shù)值與我們分離得到的酶匹配度都很低。另外，從數(shù)據(jù)庫(kù)搜索出的結(jié)果中并沒有關(guān)于纖維素酶的信息，表明此酶是一種在數(shù)據(jù)庫(kù)中沒有登記的未知蛋白質(zhì)，也說明本試驗(yàn)中分離到的內(nèi)切酶是一種新的內(nèi)切β-葡聚糖苷酶組分。

2.3 內(nèi)切β-葡聚糖苷酶的酶學(xué)性質(zhì)

2.3.1 最適pH值和溫度 pH值和溫度對(duì)內(nèi)切酶活力影響結(jié)果見圖4、圖5。結(jié)果(圖4)顯示，該酶催化反應(yīng)的最適pH值為4.5(檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液)，pH值在4.0到5.0之間酶活力較好，當(dāng)pH值上升到6.0后，酶活力下降比較快。

圖5顯示，該酶的最適反應(yīng)溫度為55℃，在50℃時(shí)，酶活力達(dá)到99%，在60℃時(shí)，酶活力仍有98%，說明該酶在50℃到60℃之間的穩(wěn)定性好。超過60℃之后，酶活力下降很快，說明該酶對(duì)熱比較敏感。

4 pH值-酶活力曲線圖ig.4 The relationship between p H value and enzymatic activities

圖5 溫度-酶活力曲線圖Fig.5 The relationship between temperature and enzymatic activities

2.3.2 金屬離子和試劑對(duì)酶活力的影響及動(dòng)力學(xué)參數(shù) 金屬離子和其他試劑對(duì)酶活力的影響如表2所示，從加入不同離子后的酶活力可以看出，乙二胺四乙酸(EDTA)、鎂離子(Mg2+)、銅離子(Cu2+)和鋅離子(Zn2+)基本對(duì)酶活力沒有影響，而鈣離子(Ca2+)對(duì)酶的抑制作用較強(qiáng)，抑制了近35%的酶活力。二價(jià)鐵離子(Fe2+)、錳離子(Mn2+)、鉛離子(Pb2+)、銨離子(NH+4)則都有不同程度的抑制作用。

表2 金屬離子和試劑對(duì)酶活力的影響Table 2 Effect of chemical reagent and ions on activities of endo-βglucanase

以羧甲基纖維素鈉作為底物，在pH 4.8、50℃條件下測(cè)定酶活力，根據(jù)Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖法作圖，根據(jù)回歸曲線得出反應(yīng)速率v與底物濃度［S］的標(biāo)準(zhǔn)方程為:1/v=8.633 9(1/［S］)+1.195 8。進(jìn)而求得以羧甲基纖維素鈉為底物時(shí)，內(nèi)切β-葡聚糖苷酶的米氏常數(shù)Km值為7.22 mg/ml。最大反應(yīng)速率Vmax為3.72 mg/(min·ml)。

3 討論

由于微生物來源的纖維素酶是多組分酶系，且各組分酶之間的分子量和等電點(diǎn)等相差不大，要將內(nèi)切β-葡聚糖苷酶組分從纖維素酶系中分離純化出來較為困難。本試驗(yàn)從康氏木霉GIMP3.444菌種的發(fā)酵產(chǎn)物中，通過(NH4)2SO4分級(jí)沉淀、DEAE Sepharose FF陰離子交換層析、Sephadex G-75凝膠過濾層析等方法分離純化出一種內(nèi)切β-葡聚糖苷酶組分，電泳檢測(cè)僅顯示1條蛋白質(zhì)條帶，說明該方法比較適宜該菌株內(nèi)切β-葡聚糖苷酶的分離純化。

本試驗(yàn)分離得到的新內(nèi)切β-葡聚糖苷酶的相對(duì)分子質(zhì)量為44 600，比活力為19.65 U/mg，最適反應(yīng)pH值和最適反應(yīng)溫度分別為4.5和55℃，Ca2+對(duì)酶有較強(qiáng)抑制作用，抑制了近35%的酶活力。以羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)為底物時(shí)，酶的米氏常數(shù)(Km)為7.22 mg/ml。該酶的質(zhì)譜分析和數(shù)據(jù)庫(kù)檢索結(jié)果表明，分離到的內(nèi)切酶蛋白質(zhì)是一種在數(shù)據(jù)庫(kù)中沒有登記的未知蛋白質(zhì)，即一種新的內(nèi)切酶組分。與文獻(xiàn)報(bào)道的內(nèi)切β-葡聚糖苷酶相比，該酶在分子量及一些酶學(xué)性質(zhì)上存在著差異，且這些差異不僅存在于不同來源微生物的酶中，還存在于相同來源微生物的酶中。由于這些差異的存在，就要求我們?cè)谘芯亢屠眠@些酶的過程中必須明確其酶學(xué)性質(zhì)，才能更好地發(fā)揮酶活性。正是由于纖維素酶系的復(fù)雜性，導(dǎo)致到目前為止對(duì)纖維素酶水解作用的機(jī)理尚未完全研究清楚，而這種新的纖維素酶組分的發(fā)現(xiàn)也能夠加深我們對(duì)纖維素酶系的組成及其在水解過程中的作用的了解。

從目前的研究看，真菌產(chǎn)生的纖維素酶普遍具有多樣性，如 Wood 等［13］、朱年青等［14］和陳冠軍等［15］分別從康氏木霉 Trichodermakoningii、里氏木霉Trichodermareesei和棘孢曲霉Asgergillusaculeatus中純化出了3種、2種和5種內(nèi)切β-葡聚糖酶，分子量和酶學(xué)性質(zhì)也各不相同。同樣從本試驗(yàn)的分離純化過程中也發(fā)現(xiàn)，康氏木霉GIMP3.444除了分泌本試驗(yàn)得到的新內(nèi)切β-葡聚糖酶外，至少還分泌另外1種內(nèi)切β-葡聚糖酶組分。因此，在研究纖維素酶系各成分酶的協(xié)同作用機(jī)理或研究纖維素酶系與其他非酶蛋白質(zhì)的協(xié)同增效作用時(shí)，需考慮這種同工酶存在的影響。

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