葉景秀

(青海省農(nóng)林科學院，青海 西寧 810016)

小麥籽粒灌漿對產(chǎn)量及品質(zhì)至關重要。前人的工作主要集中在生理生化水平的研究上，例如分析不同因素對灌漿特性的影響［1-3］，淀粉的積累規(guī)律［4］，各種酶的變化規(guī)律等［5］。然而，籽粒的灌漿是一個復雜的生理生化過程，僅從生理生化水平無法深層次地揭示其機制。

目前，隨著植物蛋白質(zhì)組學研究技術的日漸成熟，植物蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫的不斷更新，蛋白質(zhì)組學技術在水稻［6］、小麥［7］、擬南芥［8］、大豆［9］、煙草［10］等作物中的研究報道日益增多。以植物蛋白質(zhì)的提取、雙向電泳分離、質(zhì)譜鑒定等先進技術相結合，應用于小麥蛋白質(zhì)組學的研究主要集中于小麥的根、葉片、花藥、花粉等組織器官蛋白質(zhì)的雙向電泳分析及相關蛋白質(zhì)功能的初步鑒定，然而，由于受籽粒中多糖等物質(zhì)的影響，較難提取籽粒總蛋白質(zhì)，影響了蛋白質(zhì)組學技術在籽粒中的應用。在前人已發(fā)表的關于籽粒蛋白質(zhì)組學研究的文獻中，對不同作物所采取的蛋白質(zhì)提取方法各不相同。王慧娜等［11］在不同方法提取的小麥籽粒蛋白質(zhì)雙向電泳凝膠分離效果的分析比較一文中只介紹了提取方法對雙向電泳分離效果的影響，而影響雙向電泳效果的因素不僅僅是蛋白質(zhì)樣品的制備還包括蛋白質(zhì)上樣量、分離膠濃度、合適的膠條pH值等。因此，本研究對2種常用的植物組織蛋白質(zhì)提取方法進行比較，并對雙向電泳過程中膠條pH值、蛋白質(zhì)上樣量和分離膠濃度等方面進行優(yōu)化，以期探索出一套適合于小麥籽粒蛋白質(zhì)雙向電泳的技術體系，為今后開展小麥籽粒蛋白質(zhì)組學研究提供技術支撐。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

小麥青春38為青海省農(nóng)林科學院自育品種，2013年種植于青海省農(nóng)林科學院試驗地，按常規(guī)技術栽培管理，乳熟期和蠟熟期分別取穗中部籽粒，以液氮速凍，置－80℃冰箱保存。

1.2 儀器和試劑

PROTEAN IEF Cell等電聚焦系統(tǒng)、PROTEANⅡxi Cell垂直電泳系統(tǒng)、PDQuest 8.0.1凝膠圖像分析軟件均為美國Bio-Rad公司產(chǎn)品，UMAX Power-Look 2100XL光密度掃描儀為臺灣力捷公司產(chǎn)品，pH 4～7和pH 5～8線性IPG膠條、兩性電解質(zhì)等為Bio-Rad公司產(chǎn)品，苯甲基磺酰氟(PMSF)、β-巰基乙醇(β-ME)、二甲氨基丙磺酸(Chaps)、丙烯酰胺(Acrylamide)、甲叉雙丙烯酰胺(Bis-acrylamide)、四甲基乙二胺(TEMED)、二硫蘇糖醇(DTT)、過硫酸銨、碘乙酰胺、尿素為Sigma和Thermo公司產(chǎn)品，其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3 試驗方法

1.3.1 籽?？偟鞍踪|(zhì)的提取 TCA(三氯乙酸)/丙酮沉淀法:小麥籽粒加液氮研磨成粉末，參照陳蕊紅等［12］的TCA丙酮法提取總蛋白質(zhì)，略有改動。用－20℃預冷蛋白質(zhì)提取液(8%TCA，0.07%β-ME，1 mmol/L PMSF)沉淀蛋白質(zhì)，置－20℃沉淀過夜，期間振蕩多次，4℃，14 000 r/min離心30 min，棄上清，沉淀用預冷丙酮溶液(含0.07% β-ME、1 mmol/L PMSF)洗滌，－20℃ 靜置1 h后，4℃、14 000 r/min離心30 min，重復4～5次，直至蛋白質(zhì)沉淀物為純白色，將沉淀真空冷凍成干粉，－80℃冰箱保存?zhèn)溆?。酚提取?小麥籽粒加液氮研磨成細粉，轉移至離心管加適量提取液(0.1 mol/L Tris-HCl，pH8.0，1%DTT，0.9 mol/L蔗糖，1 mmol/L PMSF)，攪勻，4℃放置5 min;4℃、14 000 g離心20 min，在上清液中加入等體積的 Tris飽和酚(pH 8.0)，充分振蕩混勻，4℃靜置1 h，離心(4℃，9 000 g，5 min)，收集酚相，加入3倍體積預冷的甲醇溶液(含0.1 mol/L醋酸銨)，混勻后－20℃過夜，4℃、18 000 g離心30 min，棄上清收集沉淀，沉淀用－20℃預冷丙酮溶液(含0.1%DTT)洗滌，離心(4℃，18 000 g，30 min)，重復洗滌過程2～3次，直至蛋白質(zhì)沉淀物為純白色，將沉淀真空冷凍成干粉，－80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 蛋白質(zhì)的裂解與定量 將蛋白質(zhì)干粉溶解于水化液(8 mol/L尿素，2 mol/L硫脲，4%Chaps，65 mmol/L DTT，0.5%載體兩性電解質(zhì))，32℃水浴30 min，振蕩充分混勻后用液氮冷卻，此過程重復2次，于20℃下14 000 r/min離心15 min，吸取上清備用。蛋白質(zhì)濃度測定參考考馬斯亮藍Bradford法。

1.3.3 蛋白質(zhì)雙向電泳(2D-PAGE) 主要按IPG-phor等電聚焦系統(tǒng)指南進行。取適量蛋白質(zhì)樣品與水化液(加入痕量0.001%溴酚藍)充分混合至380 μl，沿 PROTAIN IEF Cell型電泳儀(BIO-RAD)聚焦槽內(nèi)連續(xù)加入，將17 cm IPG膠條膠面朝下覆蓋在樣品上，被動吸收1 h后，加3 ml礦物油覆蓋膠條，置于IPG等電聚焦儀的電極板上，在20℃條件下主動水化15 h使膠條充分吸脹，吸收樣品，然后以每根50μA的極限電流按表1程序進行第1向等電聚焦電泳。等電聚焦結束后，膠條分別在平衡緩沖液Ⅰ(6 mol/L 尿素，2%SDS，0.375 mol/L Tris-HCl，20%甘油，使用時加2%DTT)和平衡緩沖液Ⅱ(6 mol/L 尿素，2%SDS，0.375 mol/L Tris-HCl，20% 甘油，使用時加2.5%碘乙酰胺)中平衡15 min。第2向SDS-PAGE用12%和13%分離膠。凝膠染色采用硝酸銀染色法，其過程依次是:超純水洗2次，每次2 min，固定液［10%冰乙酸(體積比)+40%無水乙醇(體積比)］固定2.5 h，超純水快速沖洗2次，敏化液［30%甲醇(體積比)+0.2%硫代硫酸鈉(質(zhì)量體積比)+6.8%乙酸鈉(質(zhì)量體積比)］中30 min，超純水水洗3次，每次5 min，硝酸銀［0.25%硝酸銀(質(zhì)量體積比)］染色20 min，快速漂洗2次，顯影液［2.5%無水碳酸鈉(質(zhì)量體積比)+0.04%甲醛(質(zhì)量體積比)］顯影后加終止液［10%冰醋酸(體積比)］終止反應。

表1 等電聚焦電泳程序Table 1 Procedures of isoelectric focusing electrophoresis

1.3.4 圖譜掃描與分析 用 UMAX PowerLook 2100XL型光密度掃描儀透射掃描染色后的雙向電泳凝膠獲取圖像，分辨率設為600 dpi，在PDQuest 2DE 8.0.1分析軟件(美國 Bio-Rad公司)的輔助下，定義蛋白質(zhì)點的大小、強弱，檢測和統(tǒng)計蛋白質(zhì)點數(shù)目。

1.3.5 統(tǒng)計分析 用Microsoft Office Excel 2010對3次重復的2-DE圖譜上蛋白質(zhì)點數(shù)目進行統(tǒng)計分析。

2 結果

2.1 不同提取方法對蛋白質(zhì)雙向電泳圖譜質(zhì)量的影響

分別用TCA丙酮沉淀法和酚提取法提取小麥籽粒總蛋白質(zhì)，用蛋白質(zhì)裂解液裂解蛋白質(zhì)，用考馬斯亮藍 Bradford法進行蛋白質(zhì)定量，以17 cm、pH5～8 IPG膠條進行雙向電泳分離，硝酸銀染色。結果(圖1)顯示，用酚提取法提取的蛋白質(zhì)雙向電泳圖譜酸性端蛋白質(zhì)點較模糊，分辨率低，橫豎紋干擾嚴重，堿性端效果稍好，但是檢測到的蛋白質(zhì)點數(shù)偏少;而TCA丙酮沉淀法提取的蛋白質(zhì)雙向電泳凝膠圖譜蛋白質(zhì)點分布均勻，蛋白質(zhì)點清晰且更豐富，凝膠背景干凈，橫豎條紋干擾少。用PDQuest軟件統(tǒng)計分析結果顯示，在相同的參數(shù)條件下，酚提取法可分辨出約260個蛋白質(zhì)點，TCA丙酮沉淀法則可檢測到約490個清晰的蛋白質(zhì)點，比酚提取法多230個蛋白質(zhì)點。說明采用TCA丙酮沉淀法提取的小麥籽粒蛋白質(zhì)雙向電泳分離效果較好。

2.2 不同pH值IPG膠條對雙向電泳圖譜的影響

用等電點pH值4～7的IPG膠條進行的籽粒蛋白質(zhì)電泳分離結果表明，蛋白質(zhì)大多集中在堿性端，pH 4～5范圍內(nèi)蛋白質(zhì)點很少;等電點pH 5～8 IPG膠條的電泳分離結果表明:蛋白質(zhì)點分布較均勻，能更好地滿足研究分析的需求(圖2)。

圖1 不同方法提取的蛋白質(zhì)雙向電泳圖譜比較Fig.1 Comparison of 2-DE maps of proteins extracted by two methods

圖2 不同pH值IPG膠條的雙向電泳圖譜比較Fig.2 2-DE maps of protein in the systems with different p H ranges of IPG

2.3 上樣量及SDS-PAGE膠濃度對雙向電泳圖譜的影響

為了更好地分離蛋白質(zhì)，進一步比較分析了雙向電泳中不同蛋白質(zhì)上樣量和SDS-PAGE膠濃度。選用17 cm、pH 5～8 IPG 膠條，分別取300μg、380 μg和450μg蛋白質(zhì)樣品進行雙向電泳，結果見圖3。在上樣量為300μg時，雙向電泳圖譜上蛋白質(zhì)點模糊不清，低豐度蛋白質(zhì)因不能被檢測而丟失，影響了雙向電泳的準確性和重復性，經(jīng)軟件分析檢出304個蛋白質(zhì)點;在上樣量為450μg時，蛋白質(zhì)點數(shù)多，但高豐度蛋白質(zhì)點過大，出現(xiàn)飽和重疊現(xiàn)象，掩蓋了其他蛋白質(zhì)點，而且圖譜上橫條紋比較明顯，影響了蛋白質(zhì)點的分離與分析，經(jīng)軟件分析檢出570個蛋白質(zhì)點;上樣量為380μg時，蛋白質(zhì)點清晰，無橫條紋干擾，聚焦效果好，圖譜質(zhì)量最佳，經(jīng)軟件分析檢出516個蛋白質(zhì)點。

圖3 不同蛋白質(zhì)上樣量的雙向電泳圖譜比較Fig.3 2-DE maps of different loading quantities of proteins

在選用17 cm pH5～8膠條、上樣量380μg的基礎上，分別以12%和13%的SDS-PAGE膠濃度對小麥籽粒蛋白質(zhì)進行電泳分析。分離膠濃度為13%時，高分子量蛋白質(zhì)分離不充分，蛋白質(zhì)擠壓疊加，遮蓋了某些蛋白質(zhì)點在圖譜上的表達，從而降低了分辨率;分離膠濃度為12%時，蛋白質(zhì)分離較好，蛋白質(zhì)點清晰圓潤，獲得較好的分離圖譜(圖4)。

圖4 不同分離膠濃度的雙向電泳圖譜比較Fig.4 2-DE maps of protein in the systems with different gel concentrations

2.4 雙向電泳圖譜的重復性分析

蛋白質(zhì)雙向電泳圖譜的重復性，是后續(xù)蛋白質(zhì)組學分析結果可靠性的基本保障。為分析本研究建立的小麥籽粒蛋白質(zhì)雙向電泳體系的重復性，在上述優(yōu)化條件的基礎上，采用嚴格一致的操作程序，并精確控制電泳溫度與電流電壓，進行了3次雙向電泳重復試驗。經(jīng)軟件分析發(fā)現(xiàn)，3張圖譜分別檢測到490、512、531個蛋白質(zhì)點。選取其中1張凝膠圖譜作為參考膠，其余圖譜與其進行蛋白質(zhì)點匹配分析，平均匹配率達到96%。蛋白質(zhì)點位置在IPGIEF方向偏移為 (1.79±0.36)mm，在 SDS-PAGE方向偏移為 (1.65±0.41)mm。說明所建立的雙向電泳體系重復性和穩(wěn)定性均較高。

3 討論

蛋白質(zhì)組學是后基因組時代生命科學研究的一個重要領域，蛋白質(zhì)組學研究的重要性使其相關技術得到突飛猛進的發(fā)展［13］。其中，雙向電泳作為分離分析蛋白質(zhì)的重要手段，在蛋白質(zhì)組研究中發(fā)揮著關鍵作用。因此，對雙向電泳條件進行優(yōu)化顯得尤為重要。

樣品制備是雙向電泳的第一步，采用不同方法提取的蛋白質(zhì)電泳效果不同。增廣娟等［14］比較了蘋果葉片蛋白質(zhì)的不同提取方法，結果表明改良的Tris-HCl提取法的蛋白質(zhì)點最多，雙向電泳效果最好。陳蕊紅等［12］比較分析了不同小麥花藥蛋白質(zhì)提取方法，發(fā)現(xiàn)TCA丙酮法提取效果較好。石海波等［15］對玉米籽粒蛋白質(zhì)不同提取方法的研究結果表明，可溶性蛋白質(zhì)提取法獲得的蛋白質(zhì)純度高、濃度適中、雙向電泳蛋白質(zhì)點最豐富，最適合雙向電泳研究。李奇松等［16］對比了3種不同的蛋白質(zhì)提取方法，結果表明可溶性蛋白質(zhì)提取法最適用于籽粒蛋白質(zhì)組學的研究。本試驗對比分析了用途較為廣泛的TCA丙酮沉淀法和酚提取法，結果表明TCA丙酮沉淀法比較適用于雙向電泳圖譜分析，這與王慧娜等［11］的研究結果有分歧，推測可能與提取過程中所用的試劑配方不同有關。

雙向電泳體系中電泳條件包括膠條pH值、上樣量和SDS-PAGE分離膠濃度等方面［17］。理想的IPG膠條，既要覆蓋樣品中全部蛋白質(zhì)的等電點，又不能因等電點相對集中導致大量蛋白質(zhì)點聚集在一起。本研究根據(jù)前期對小麥葉片蛋白質(zhì)雙向電泳分離試驗的經(jīng)驗，首先采用了等電點pH值4～7的IPG膠條對小麥籽粒蛋白質(zhì)進行分離，發(fā)現(xiàn)大部分蛋白質(zhì)集中在堿性端，蛋白質(zhì)點之間緊密相連，甚至重疊在一起，模糊且不易區(qū)分，改用等電點pH 5～8的IPG膠條后，籽粒蛋白質(zhì)分辨率顯著提高，分離效果較好，檢測到的蛋白質(zhì)點數(shù)多。

合適的上樣量和分離膠濃度在雙向電泳中是非常重要的。過大的上樣量和分離膠濃度，容易導致蛋白質(zhì)大量聚集，遮蓋部分蛋白質(zhì)點的表達，無法反映蛋白質(zhì)組的全部信息;上樣量和分離膠濃度過低會導致一些低分子量和低豐度蛋白質(zhì)超出凝膠所容納的范圍，不能在雙向電泳圖譜上顯現(xiàn)。上樣量的多少與IPG膠條的長度、pH值和蛋白質(zhì)染色方法密切相關。本研究在選用長度17 cm、pH5～8 IPG膠條，采用硝酸銀染色的基礎上借鑒以往的操作經(jīng)驗，比較了不同上樣量(300 μg、380 μg、450 μg)的雙向電泳效果，結果表明蛋白質(zhì)點數(shù)量隨上樣量的增加而增多，但是當上樣量增加到450μg時，蛋白質(zhì)點數(shù)量比上樣量380 μg時略有增多，但是蛋白質(zhì)點之間出現(xiàn)了互相重疊，相互干擾現(xiàn)象，表明380μg的上樣量較佳。在此基礎上比較了分離膠濃度12%和13%的SDS-PAGE凝膠電泳圖譜，發(fā)現(xiàn)12%的分離膠濃度能夠更有效地分離小麥籽粒蛋白質(zhì)。3次重復試驗結果表明，本研究建立的雙向電泳體系重復性較好。

綜上所述，應用本研究建立的雙向電泳體系，能夠獲得重復性好、蛋白質(zhì)點清晰、數(shù)量豐富的雙向電泳圖譜，該體系適合于小麥籽粒全蛋白質(zhì)的雙向電泳分析。

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