楊景霏，廖進(jìn)齊，陳 敏，蔡小康，李仲娟△

(1.湖北省武鋼三中，湖北武漢 430080；2.湖北理工學(xué)院，湖北黃石 435003)

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·論 著·

手性修飾氧化石墨衍生物對小鼠成神經(jīng)瘤細(xì)胞活性的影響*

楊景霏1，廖進(jìn)齊2，陳 敏2，蔡小康2，李仲娟2△

(1.湖北省武鋼三中，湖北武漢 430080；2.湖北理工學(xué)院，湖北黃石 435003)

目的 比較手性修飾的氧化石墨(GO)衍生物對小鼠成神經(jīng)瘤細(xì)胞N2a活性的影響。方法 倒置熒光顯微鏡觀察N2a細(xì)胞形態(tài)，MTT法檢測N2a 細(xì)胞的活性。結(jié)果 在0.1～0.4 μmol/L濃度GO衍生物對N2a 細(xì)胞活性影響呈濃度相關(guān)，其中0.4 μmol/L的GO衍生物對N2a 細(xì)胞生長狀況最好；L-型GO(L-GO)和D-型GO(D-GO)促N2a 細(xì)胞增殖率分別為94%和52%，二者差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。結(jié)論 手性修飾的GO衍生物在0.1～0.4 μmol/L能促進(jìn)N2a 細(xì)胞生長，L-GO促進(jìn)N2a 細(xì)胞生長活性比D-GO強(qiáng)。

氧化石墨； 小鼠成神經(jīng)瘤細(xì)胞； 細(xì)胞活性

氧化石墨(graphite oxide,GO)是石墨經(jīng)氧化而成的新型納米級材料，人們很早就預(yù)測石墨烯在生物醫(yī)藥領(lǐng)域?qū)袕V泛的應(yīng)用前景[1-2]，GO經(jīng)超聲處理后得到GO溶液，GO通過L(D)-半胱氨酸的還原可以得到不同手性衍生物[3]。本實驗通過L-GO和D-GO對N2a 細(xì)胞生長狀況的考察，探討其在醫(yī)藥應(yīng)用中可能存在的差異性。

1 材料與儀器

1.1 材料 手性修飾的GO衍生物由武漢理工大學(xué)分子材料實驗室友情提供。小鼠成神經(jīng)瘤細(xì)胞N2a購自武漢細(xì)胞保存中心，Hanks液、臺盼藍(lán)、胎牛血清和 PRMI-1640培養(yǎng)粉購自Gibco公司，MTT購自上海博谷生物科技有限公司。培養(yǎng)瓶、胰蛋白酶、培養(yǎng)板和細(xì)胞培養(yǎng)用的吸頭購自美國Costar公司。二甲基亞砜(dimethyl-sulfoxide，DMSO) 購自Sigma公司。

1.2 儀器 蘇州凈化二級生物安全柜BHC-1300ⅡB2，美國ThermoFisher賀利氏CO2培養(yǎng)箱，美國伯樂DNM-9602型酶標(biāo)儀，日本Olympus CKX41倒置生物顯微鏡及Olympus 1X74倒置熒光顯微鏡。

1.3 方法

1.3.1 小鼠成神經(jīng)瘤細(xì)胞N2a的培養(yǎng)[4]N2a以按105個細(xì)胞/瓶用DMEM-F12培養(yǎng)液置37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行貼壁培養(yǎng)(培養(yǎng)液含10%胎牛血清、雙抗100 U/mL青霉素以及100 μg/mL硫酸鏈霉素)，每3天用胰酶消化收集細(xì)胞洗滌后更換培養(yǎng)液，取對數(shù)期細(xì)胞進(jìn)行實驗。

1.3.2 MTT法檢測細(xì)胞活性[5]在96孔培養(yǎng)板中，按104個細(xì)胞/孔進(jìn)行培養(yǎng)，24 h后于不同孔內(nèi)分別加入0.1～0.4 μmol/L濃度L-GO或D-GO液，培養(yǎng)72 h后加20 μL MTT溶液繼續(xù)培養(yǎng)4 h，再加入150 μL二甲基亞砜(DMSO) 振蕩10 min，490 nm處測吸光度(OD) 值。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 采用 Excel分析軟件，用t檢驗對各組數(shù)據(jù)進(jìn)行比較。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 小鼠成神經(jīng)瘤細(xì)胞的觀察 對數(shù)期N2a細(xì)胞經(jīng)胰蛋白酶消化后用2%胎牛血清Hanks液洗滌，臺盼藍(lán)計數(shù)活細(xì)胞，按2×104/L的細(xì)胞濃度分別加入L-GO和D-GO刺激物在6孔培養(yǎng)板培養(yǎng)3 d，以沒有刺激細(xì)胞培養(yǎng)孔為空白對照。倒置熒光顯微鏡觀察，無刺激物的對照組細(xì)胞呈梭形，圓形或多角生長，培養(yǎng)孔中無漂浮死細(xì)胞；L-GO刺激后的細(xì)胞呈梭形或多角形蔓延生長，可見極少的漂浮細(xì)胞；D-GO刺激后的細(xì)胞蔓延生長，細(xì)胞老化程度較高，可見部分細(xì)胞邊界不清，如圖1。

2.2 不同濃度GO衍生物對N2a細(xì)胞生長活性的影響 對數(shù)期N2a細(xì)胞按2×105/L濃度接種于96孔培養(yǎng)板，分別加入L-GO和D-GO刺激培養(yǎng)3 d，用酶標(biāo)儀檢測各孔的吸光度，按刺激物濃度作圖，圖2顯示0.1～0.4 μmol/L刺激物對N2a細(xì)胞呈濃度依賴，刺激物濃度在0.4 μmol/L最好，L-GO對N2a細(xì)胞的活性高于D-GO，各濃度比對差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

圖1 顯微鏡觀察N2a細(xì)胞生長活性

圖2 GO衍生物對N2a細(xì)胞生長活性比較

2.3 0.4 μmol/L GO衍生物對N2a細(xì)胞增殖比較 圖3結(jié)果顯示，L-GO對N2a細(xì)胞的活性為94%，D-GO對N2a 細(xì)胞的活性為52%，兩者間統(tǒng)計學(xué)分析差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

圖3 0.4 μmol/L GO衍生物對N2a細(xì)胞生長活性的比較

3 討 論

GO衍生物是單原子結(jié)構(gòu)，表面有很多的含氧活性基團(tuán)，生物相容性很好，而且十分有利于對GO的表面進(jìn)行化學(xué)功能化修飾。由于氧化石墨烯表面含有羥基、環(huán)氧基、羧基等基團(tuán)，這些基團(tuán)成為氧化石墨烯發(fā)揮功能的活性中心[6]。氧化石墨烯在生物醫(yī)學(xué)方面的應(yīng)用發(fā)展十分迅速。最近幾年，氧化石墨烯在疾病診斷方面，微生物學(xué)方向，藥物的運輸以及分子生物學(xué)等方面得到了各研究學(xué)者的廣泛關(guān)注[7]，國外也有學(xué)者將其作為藥物載體開發(fā)[8-9]。最近在阿爾茨海默病(AD)研究中，由于GO衍生物能透過血腦屏障，對神經(jīng)瘤模型細(xì)胞具有活性[10]，因此，GO衍生物也作為靶向藥物正在被研究[11]。本實驗以N2a 細(xì)胞為模型，分別考察L-GO和 D-GO誘導(dǎo)下該細(xì)胞的生長活性。結(jié)果顯示，0.1～0.4 μmol/L GO衍生物對N2a 細(xì)胞的活性呈濃度依存，L-GO對N2a 細(xì)胞的生長更有促進(jìn)作用，兩者之間的活性差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。L-GO和D-GO的這種差異性，為GO衍生物作為靶向藥物的進(jìn)一步開發(fā)提供了科學(xué)依據(jù)。

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Influence of chirally modified graphite oxide derivatives on activity of mouse neuroblastoma cells N2a*

YANGJing-fei1,LIAOJin-qi2,CHENMin2,CAIXiao-kang2,LIZhong-juan2△

(1.No.3HighSchoolofWuhanIronandSteelCorporation,Wuhan,Hubei430080,China;2.HubeiPolytechnicUniversity,Huangshi,Hubei435003,China)

Objective To compare the influence of chirally modified graphite oxide (GO) derivatives on the activity of mouse neuroblastoma N2a cells.Methods The morphological change of N2a cells was observed by the inversion fluorescence microscope and the activity of N2a cells was measured by the MTT method.Results The influence of GO derivatives in the concentration range of 0.1-0.4 μmol/L on the activity of N2a cells showed the concentration correlation,in which the GO derivatives with the concentration of 0.4μmol/L was best for the growth status of the N2a cells;the promoting N2a cells proliferation rates of the L-type GO and D-type GO were 94% and 52% respectively,the difference between them revealed the statistical significance(P<0.01).Conclusion The chirally modified GO derivatives in the concentration range of 0.1-0.4 μmol/L could promote N2a cell growth,and the activity of L-GO promoting N2a cell growth is stronger than that of D-GO.

graphite oxide； mouse neuroblastoma N2a cells； cellular activity

教育部留學(xué)生啟動資金(46-1)；湖北理工學(xué)院創(chuàng)新團(tuán)隊項目組(201025)。

楊景霏，女，在校學(xué)生，研究方向為細(xì)胞生物學(xué)?！?/p>

，E-mail:1525677891@qq.com。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.02.005

A

1672-9455(2015)02-0153-02

2014-05-09

2014-11-04)