張 宇，李 冬，戴 燕，鄭為超，萬海英△

(1.同濟大學(xué)附屬同濟醫(yī)院檢驗科，上海 200065；2.安徽理工大學(xué)醫(yī)學(xué)院，安徽淮南 232001)

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·論 著·

羅氏LightCycler Nano熒光定量PCR儀性能評價*

張 宇1，李 冬1，戴 燕1，鄭為超2，萬海英1△

(1.同濟大學(xué)附屬同濟醫(yī)院檢驗科，上海 200065；2.安徽理工大學(xué)醫(yī)學(xué)院，安徽淮南 232001)

目的 對美國羅氏公司LightCycler Nano 32孔熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)儀的主要性能指標進行評價。方法 按照美國臨床實驗室標準化協(xié)會(CLSI)制定的評價標準，評價儀器精密度、準確度、靈敏度、可報告范圍、儀器間比對等指標。結(jié)果 LightCycler Nano精密度批內(nèi)變異系數(shù)(CV)為2.63%、1.51%，批間CV為6.2%、4.15%；準確度與室間質(zhì)控物比較，5個標本均在靶值區(qū)間內(nèi)；靈敏度檢測CV≤10%；可報告范圍為最大稀釋比例1∶100；與比對儀器的比對結(jié)果偏差結(jié)果均小于15%。結(jié)論 羅氏LightCycler Nano熒光定量PCR儀5項性能經(jīng)驗證后與廠家提供的性能參數(shù)相符，可以用于臨床檢測。

LightCycler Nano； PCR； 性能評價； 精密度

目前聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)定量檢測技術(shù)在各級實驗室中使用越來越廣泛[1]，其中ABI公司7700、7500型96孔PCR儀應(yīng)用較為廣泛，但很多實驗室對通量要求不高[2],同時大部分省市級檢驗科PCR結(jié)果報告時間為3 d左右，原因之一為積攢足夠批量標本后進行檢測，大大降低了報告及時率，一定程度上影響患者就診效率，增加醫(yī)療開支，羅氏新推出的LightCycler Nano 32孔熒光定量PCR儀，具有中等通量，高精確度，支持快速PCR，軟件分析直觀，價格為常規(guī)PCR的一半，體積小等特點，能夠在大大縮短運轉(zhuǎn)周期的同時減低實驗室成本消耗，同時能為科研個體化、低通量、快速提供一個個人化的定量平臺[3]。同濟醫(yī)院檢驗科在使用LightCycler Nano后，對其主要性能指標進行評價分析，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 主要儀器：LightCycler Nano熒光定量PCR儀(美國羅氏公司)，低溫高速離心機(德國Eppendorf公司)，生物安全柜等。試劑：乙型肝炎病毒(HBV)-PCR熒光定量檢測試劑盒(日本Takara公司)。標準血清，上海臨床檢驗中心提供。檢測標本來源：收集足夠量的患者血清20份。

1.2 方法

1.2.1 精密度檢測 按照美國臨床實驗室標準化協(xié)會(CLSI)制定的評價標準EP15A要求收集兩個水平(Level 2低值、Level 1高值)的患者血清，批內(nèi)精密度一天各測定20次，計算平均值和變異系數(shù)(CV)值；批間精密度，每日各測一次，連續(xù)20 d，計平均值和CV值。

1.2.2 準確度檢測 使用參加上海市臨檢中心下發(fā)的5份室間質(zhì)控品進行檢測，按照CLSI-EP15A規(guī)則，檢測本室檢測值是否落在靶值范圍內(nèi)或靶值在TEa(CLIA′88)允許范圍內(nèi)。

1.2.4 可報告范圍 收集高值即檢測上限(HBV-DNA 1.00×107IU/mL)患者標本。將患者標本用廠家指定的稀釋液按比例進行稀釋后上機檢測，檢測其最高稀釋倍數(shù)是否高于廠家指定值(1∶100)。計算測試均值與理論值的比值，如在80%～120%之內(nèi)的最大稀釋度，為本室可接受的最大稀釋度。

1.2.5 儀器間比對 準備5份標本，濃度覆蓋醫(yī)學(xué)決定水平。在基準儀器和比對儀器(ABI 7700)上檢測這5份標本，每份標本檢測2 次取均值計算比對儀器和基準儀器之間的結(jié)果偏差(CV)百分比。5份標本CV≤15%為符合要求。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用統(tǒng)計軟件SPSS17.0進行統(tǒng)計學(xué)處理，計量資料采用t檢驗，兩變量間線性關(guān)系分析采用直線相關(guān)及回歸分析。

2 結(jié) 果

2.1 儀器精密度檢測結(jié)果 批內(nèi)精密度：低值均值±s為4.45±0.12，CV為2.63%，高值均值±s為6.52±0.1，CV為1.51%。批間精密度：低值均值±s為4.41±0.32，CV為6.2%，高值均值±s為6.39±0.2，CV為4.15%。本室檢測值均落在廠家提供的CV范圍內(nèi)或在TEa(CLIA′88)允許范圍內(nèi)。

2.2 準確度檢測結(jié)果 本室檢測值0、4.76、5.71、3.56、6.74均落在靶值范圍內(nèi)或靶值在TEa(CLIA′88)允許范圍內(nèi)(0～0、4.39～5.39、5.34～6.34、3.42～4.42、6.38～7.38)。

2.3 靈敏度驗證結(jié)果 本室檢測結(jié)果為3.543，s為0.165，CV為4.67%，符合廠家要求范圍內(nèi)(CV≤10%)。

2.4 可報告范圍驗證結(jié)果 按照廠家最大稀釋倍數(shù)1∶100后，測試均值為5.98，理論值為5.81，測試均值與理論值的比值為102.84%，在80%～120%之內(nèi)。1∶100為本科室可接受的最大稀釋度，符合廠家提供的最高稀釋倍數(shù)。

2.5 儀器間比對結(jié)果 5份標本比對儀器和基準儀器之間的結(jié)果偏差(CV)百分比分別為0.0%、0.1%、2.1%、0.3%、2.5%均小于15%符合要求。

3 討 論

經(jīng)驗證羅氏LightCycler Nano 32孔熒光定量PCR儀，精密度、準確度、靈敏度、可報告范圍、儀器間比對5個項目的各項性能指標與廠家提供的性能參數(shù)相符。定量PCR儀主要借助標本及標準品之間對比來實現(xiàn)定量[4-5]，對于定量PCR系統(tǒng)，重要性能除了傳統(tǒng)PCR的升溫速度及溫控穩(wěn)定性、精確性外，更重要的在于標本孔之間均一性，大大減少孔間差異造成的指數(shù)級放大[6]。羅氏LightCycler Nano 32孔熒光定量PCR儀，采用Therma-BaseTM熱循環(huán)專利技術(shù)和先進的光學(xué)檢測系統(tǒng)，徹底消除邊緣效應(yīng)，可靠的光學(xué)裝置提供了完整的光譜信息，保持穩(wěn)定優(yōu)異的檢測結(jié)果[7]。熒光檢測系統(tǒng)，多色多通道檢測是當今的主流[8]。支持所有常用的檢測染料，不需要DOX。該儀器外形小巧，其體積為常規(guī)PCR儀體積的1/4，可隨意搬動，不受實驗室的空間限制。便于經(jīng)常要開展實時定量PCR分析，但通量中等的實驗室。

目前在臨床上PCR主要用于檢測各種細菌及病毒DNA，為實驗診斷提供分子生物學(xué)依據(jù)。其中乙型肝炎病毒(HBV)-DNA檢測在各級實驗室檢測中最為常用。我國屬HBV感染高流行區(qū),一般人群的乙型肝炎表面抗原(HBsAg)陽性率為9.09%[9]，目前臨床上常用熒光定量PCR法檢測HBV-DNA，熒光定量PCR技術(shù)把PCR、雜交及光譜技術(shù)相融合,達到了對原始模板量定量的目的。HBV-DNA是HBV的遺傳質(zhì),HBV-DNA(PCR)是從血清中檢測HBV存在的靈敏而直接的方法[10]。LightCycler Nano 32孔熒光定量PCR儀可作為一種快速、準確的分子生物學(xué)檢測儀器，其結(jié)果可以直接反映體內(nèi)HBV感染狀態(tài)及病毒載量情況，有利于判斷疾病的嚴重程度和傳染性,更有利于臨床治療的藥物選擇和療效觀察。

此外，LightCycler Nano軟件設(shè)計更為直觀，分析設(shè)計及數(shù)據(jù)分析一體化，大大提高了檢測效率，同時小通量、支持快速PCR的設(shè)計，便于每日操作，降低檢測成本，縮短報告周期。符合當今臨床檢驗實驗室，橫向聯(lián)合科研型實驗室發(fā)展的趨勢。本實驗經(jīng)過驗證該儀器的主要性能指標，符合廠家提供的性能參數(shù)相符，可以在實驗室應(yīng)用于臨床檢測。

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Performance evaluation of Roche LightCycler Nano fluorogenic quantitative PCR instrument*

ZHANGYu1,LIDong1,DAIYan1,ZHENGWei-chao2,WANHai-ying1△

(1.DepartmentofClinicalLaboratory,AffiliatedTongjiHospital,TongjiUniversity,Shanghai200065,China；2.MedicalCollege,AnhuiUniversityofScienceandTechnology,Huainan,Anhui232001,China)

Objective To evaluate the major performance indexes of American Roche LightCycler Nano 32 holes fluorogenic quantitative PCR instrument.Methods According to the evaluation standard formulated by the Clinical and Laboratory Standars Institute(CLSI),the precision,accuracy,sensitivity,reportable range and comparison between the instruments were evaluated.Results The coefficients of variation(CV) for within-run assays were 2.63% and 1.51% respectively;CVfor between-run assays were 6.2% and 4.15% respectively;comparing the accuracy with the between-run quality control material,the five samples were within the target value range;CVfor sensitivity was ≤ 10%;the reportable range of the maximum dilution was 1∶100;the bias of the comparison results with the comparative instrument was less than 15%.Conclusion The verified 5 items of performance in the Roche LightCycler Nano fluorogenic quantitative PCR instrument conform to the performance parameters provided by the manufacturer,indicating that this instrument can be applied in clinical testing in our laboratory.

LightCycler Nano; PCR; performance evaluation; precision

國家自然科學(xué)基金資助項目(81273777)；國家自然科學(xué)基金資助項目(81272603)；上海市浦江人才計劃項目(13PJ1407300)；安徽省自然科學(xué)基金項目(11040606M203)。

張宇，女，檢驗技師，碩士研究生，研究方向是分子免疫、檢驗醫(yī)學(xué)、中醫(yī)藥免疫?！?/p>

，E-mail：whysz@163.com。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.02.001

A

1672-9455(2015)02-0145-02

2014-05-26

2014-10-23)