龍海燕,楊菁玉 綜述，馮 萍 審校(四川大學(xué)華西醫(yī)院感染性疾病中心，成都 610041)

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·綜 述·

艱難梭菌感染實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)及其研究進(jìn)展

龍海燕,楊菁玉 綜述，馮 萍△審校(四川大學(xué)華西醫(yī)院感染性疾病中心，成都 610041)

艱難梭菌； 細(xì)菌培養(yǎng)； 毒素檢測(cè)； 免疫學(xué)； 分子生物學(xué)

艱難梭菌(CD)是一種專(zhuān)性厭氧的革蘭染色陽(yáng)性芽孢桿菌，它廣泛分布于自然環(huán)境、動(dòng)物和人的糞便中，芽孢抵抗力較強(qiáng)，可在外界環(huán)境存活數(shù)周至數(shù)月。CD本身沒(méi)有侵襲性，部分產(chǎn)毒細(xì)菌通過(guò)分泌毒素A、毒素B及二元毒素引起抗菌藥物相關(guān)性腹瀉、結(jié)腸炎甚至致死性假膜性腸炎，統(tǒng)稱(chēng)為艱難梭菌感染(CDI)。廣譜抗菌藥物的使用、炎性反應(yīng)腸病、慢性肝病、器官移植、化療、長(zhǎng)期使用激素、丙種球蛋白減少等患者以及懷孕及分娩前后的婦女更易發(fā)生CDI[1]。目前，CD是公認(rèn)的院內(nèi)感染和抗菌藥物相關(guān)性腹瀉最重要的病因。進(jìn)入21世紀(jì)以來(lái)，CDI發(fā)病率和疾病嚴(yán)重程度在全球范圍內(nèi)呈上升趨勢(shì)。而我國(guó)多數(shù)醫(yī)院對(duì)CDI檢查手段有限，診斷率低，因此,目前對(duì)早期、快速、準(zhǔn)確、廉價(jià)地診斷CDI提出了更高要求，以期早期治療，降低住院時(shí)間、病死率等。本文就現(xiàn)有CDI檢測(cè)技術(shù)及其進(jìn)展作一綜述。

1 CD毒素檢測(cè)

1.1 細(xì)胞毒性試驗(yàn)(CTA) CTA是通過(guò)驗(yàn)證標(biāo)本中存在特異性毒性效應(yīng)產(chǎn)物來(lái)診斷CDI，主要原理是將過(guò)濾的糞便抽提物接種至處于生長(zhǎng)的健康單層細(xì)胞中培養(yǎng)24～48 h，若樣本中存在CD毒素則會(huì)出現(xiàn)特殊的細(xì)胞病變效應(yīng)(細(xì)胞變圓)，為明確其特異性需再在樣本中加入特定的抗毒素進(jìn)行細(xì)胞毒素中和試驗(yàn)。研究發(fā)現(xiàn)，毒素B所致的細(xì)胞病變效力是毒素A的103～104倍[2]。CTA因其敏感性和特異性高曾被美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局認(rèn)定為檢測(cè)CDI的金標(biāo)準(zhǔn)。但是CTA需要難度較高細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，測(cè)定時(shí)間長(zhǎng)，受標(biāo)本稀釋濃度等影響使其在常規(guī)臨床微生物實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用有一定困難。

1.2 A/B毒素的免疫學(xué)檢測(cè)(A/B EIA) 該方法是通過(guò)檢測(cè)CD產(chǎn)生的主要毒素來(lái)判斷CDI。CD通常產(chǎn)生A、B兩種毒素，以前免疫學(xué)常針對(duì)的是毒素A，但近年國(guó)內(nèi)外均有A/B+株報(bào)道，且該菌株仍可導(dǎo)致嚴(yán)重CDI[3]。因此，現(xiàn)在都同時(shí)檢測(cè)A、B兩種毒素以提高檢測(cè)的靈敏度。目前主要采用酶聯(lián)免疫法、免疫層析法等。其基本原理是通過(guò)抗原抗體反應(yīng)使酶標(biāo)抗體(或抗原)結(jié)合到載體上，經(jīng)洗滌或?qū)游龊笈c底物反應(yīng)顯色，根據(jù)顏色深淺進(jìn)行定性或定量分析，數(shù)小時(shí)即可得出結(jié)果，是一種快速、簡(jiǎn)單、便宜、設(shè)備技術(shù)要求不高的檢測(cè)手段，目前已經(jīng)有大量的商品試劑盒上市。以前A/B EIA是應(yīng)用最為廣泛的診斷方法。但有研究表明，與產(chǎn)毒株培養(yǎng)相比其敏感性為32.8%～57.1%，而且在臨床中標(biāo)本留取到正式進(jìn)入檢測(cè)的時(shí)間如果較長(zhǎng)，則毒素容易分解，易造成假陰性[4]。目前普遍認(rèn)為EIA不能被作為一個(gè)單獨(dú)診斷CDI的檢查方法。CD毒素是導(dǎo)致CDI最直接的原因，因此毒素檢測(cè)對(duì)于CDI診斷具有很高特異性，但是其敏感性仍值得商榷。曾有報(bào)道，1例經(jīng)腸鏡檢查診斷為偽膜性腸炎的患者攜帶有CD產(chǎn)毒株，但是卻未檢測(cè)到CD毒素，在一定程度上提示若只依靠毒素檢測(cè)可能會(huì)導(dǎo)致某些CDI的漏診[5]。而關(guān)于毒素陽(yáng)性與疾病嚴(yán)重程度的關(guān)系也存在一定分歧，這可能是由檢測(cè)方法不同導(dǎo)致[6-8]。英國(guó)衛(wèi)生部所發(fā)布的指南指出，只有檢測(cè)出CD毒素的患者才能上報(bào)CDI，因此毒素檢測(cè)在臨床上仍占有重要的位置。

2 CD細(xì)菌學(xué)檢測(cè)

2.1 細(xì)菌培養(yǎng) 這是CDI的傳統(tǒng)檢測(cè)方法，其主要步驟是預(yù)處理大便后，接種至CD選擇性培養(yǎng)基-環(huán)絲氨酸頭孢西丁果糖瓊脂(CCFA)中，厭氧環(huán)境下至少培養(yǎng)48 h。如果有著足夠相關(guān)經(jīng)驗(yàn)，根據(jù)培養(yǎng)基上菌落形態(tài)及革蘭染色陽(yáng)性的證實(shí)就可明確有無(wú)CD，可疑者可進(jìn)行進(jìn)一步的生化鑒定。目前在傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法上也有一定的改進(jìn)，如在CCFA中加入?；悄懰徕c或者溶菌酶更有助于芽孢的富集，從而提高了敏感性[9]。CD培養(yǎng)敏感性高，培養(yǎng)得到的細(xì)菌可以進(jìn)一步進(jìn)行毒素分析、細(xì)菌分型、耐藥分析等，有利于流行病學(xué)調(diào)查研究。但是厭氧菌標(biāo)本收集要求高，培養(yǎng)難度大，陽(yáng)性率受操作人員經(jīng)驗(yàn)影響大，所需時(shí)間長(zhǎng)，檢驗(yàn)成本較高，在臨床實(shí)驗(yàn)室未常規(guī)開(kāi)展，主要用于科研方面。若培養(yǎng)為細(xì)菌陽(yáng)性者也不能區(qū)別其是否產(chǎn)毒，因此，限制其進(jìn)一步的應(yīng)用。

2.2 CD共同抗原(GDH)檢測(cè) CD共同抗原是CD表面大量表達(dá)的谷氨酸脫氫酶，目前主要用免疫學(xué)方法直接檢測(cè)大便中的GDH抗原。Crobach等[10]研究發(fā)現(xiàn)，GDH檢測(cè)與細(xì)菌培養(yǎng)和產(chǎn)毒株培養(yǎng)比較，其平均敏感性分別為88%和60%。Shetty等[11]用Meta分析發(fā)現(xiàn)，GDH檢測(cè)的陰性預(yù)測(cè)值在94.6%～100%。GDH穩(wěn)定性和靈敏度較高，不易受到標(biāo)本存放時(shí)間的影響，但不能區(qū)分是否為產(chǎn)毒株，且其最大優(yōu)勢(shì)在于有很高的陰性預(yù)測(cè)值，陰性結(jié)果者即可基本排除CD的存在，陽(yáng)性者可再進(jìn)一步行毒素或產(chǎn)毒基因檢測(cè)，因此可以作為二步法或三步法的篩查試驗(yàn)。

3 CD產(chǎn)毒菌株檢測(cè)

3.1 產(chǎn)毒菌株培養(yǎng)(TC) TC包括CD培養(yǎng)和毒素檢測(cè)兩個(gè)步驟。CD培養(yǎng)陽(yáng)性者再進(jìn)行毒素檢測(cè)，后者主要有細(xì)胞毒性檢測(cè)，聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)檢測(cè)毒性基因，免疫法檢測(cè)毒素A/B等。聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)只是檢測(cè)毒素基因，其有不一定表達(dá)或表達(dá)量太少無(wú)法致病的可能，而A/B EIA敏感性不高，因此目前產(chǎn)毒菌株培養(yǎng)是指CD培養(yǎng)加細(xì)胞毒性檢測(cè)才是公認(rèn)的診斷CDI的金標(biāo)準(zhǔn)[12[13-14]。

3.2 核酸擴(kuò)增試驗(yàn)(NAAT)

3.2.1 PCR 因?yàn)樗挟a(chǎn)毒菌株都攜帶B毒素基因，因此大部分PCR主要針對(duì)艱難梭菌B毒素基因tcdB，也有針對(duì)艱難梭菌A毒素基因tcdA，負(fù)向調(diào)節(jié)基因tcdC，編碼二元毒素的基因cdtA和cdtB，CD的特異性基因等。在普通PCR基礎(chǔ)上已經(jīng)發(fā)展出實(shí)時(shí)熒光PCR，多重PCR等技術(shù)應(yīng)用于CDI檢測(cè)。Deshpande等[15]用Meta分析發(fā)現(xiàn)，實(shí)時(shí)熒光PCR與TC和CTA相比，其平均敏感性和特異性分別為90%、96%、89%、97%。Persson等[16]使用多重PCR檢測(cè)tcdA、tcdB、ctdA、cdtB和tcdC，發(fā)現(xiàn)其對(duì)027核酸型有很高特異性，并且能檢測(cè)其他CD臨床類(lèi)型，對(duì)流行病學(xué)也有重要意義。目前已經(jīng)有多種商品試劑盒上市，有些可直接用于糞便檢測(cè)，耗時(shí)1～5 h不等，因其快速、高敏感性而被廣泛認(rèn)可。但是PCR仍存在一些問(wèn)題：如引物結(jié)合區(qū)基因修飾導(dǎo)致假陰性結(jié)果；只攜帶產(chǎn)毒基因卻不表達(dá)或少量表達(dá)而不足以致??；無(wú)法區(qū)分疾病嚴(yán)重程度；新型菌株出現(xiàn)時(shí)易漏診，檢測(cè)費(fèi)用昂貴等。

3.2.2 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(LAMP) 因LAMP對(duì)目標(biāo)基因長(zhǎng)度只能控制在200 bp左右，因此其針對(duì)的是tcdA。LAMP是利用鏈置換反應(yīng)在一定溫度下進(jìn)行，反應(yīng)只需將基因模板、4種針對(duì)靶基因的6個(gè)區(qū)域的特異性引物、鏈置換型DNA合成酶、基質(zhì)等共同置于一定溫度(60～65 ℃)下，經(jīng)1個(gè)步驟即可完成。Lalande等[17]以產(chǎn)毒株培養(yǎng)為金標(biāo)準(zhǔn)，用LAMP檢測(cè)CD發(fā)現(xiàn),敏感性和特異性分別可達(dá)91.8%和99.1%且可1 h內(nèi)出結(jié)果。Boyanton等[18]用實(shí)時(shí)熒光PCR與LAMP相比發(fā)現(xiàn)兩者在敏感性上相差無(wú)幾，后者特異性稍低一些，但都遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)A/B EIA。該方法檢測(cè)時(shí)間短(1 h左右)、設(shè)備簡(jiǎn)單、操作簡(jiǎn)便、費(fèi)用相對(duì)便宜，配合相應(yīng)顯色試劑還能實(shí)現(xiàn)肉眼判別結(jié)果。但其缺點(diǎn)是容易污染，造成假陽(yáng)性結(jié)果；有些產(chǎn)毒菌株有tcdA缺失，從一定程度上影響了LAMP準(zhǔn)確度。

3.2.3 依賴(lài)解螺旋酶恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(HDA) 該技術(shù)是2004年報(bào)道的一種新型恒溫基因擴(kuò)增技術(shù)。HDA基本原理是先用解旋酶解開(kāi)雙鏈DNA，再依靠單鏈DNA結(jié)合蛋白與模板單鏈結(jié)合，使模板單鏈處于單鏈狀態(tài)并保護(hù)它的完整性，引物與模板雜交，然后在DNA聚合酶催化下擴(kuò)增，新合成的雙鏈DNA即產(chǎn)物作為底物進(jìn)入下一輪擴(kuò)增。目前有分別針對(duì)tcdA、tcdB的HDA。Deak等[19]發(fā)現(xiàn)AmpliVue C.Difficile assay(針對(duì)tcdA)與LAMP法比較，其敏感性和特異性分別為96%、100%。有學(xué)者對(duì)The Portrait Toxigenic C.difficile assay(針對(duì)tcdB)進(jìn)行了一個(gè)多中心的臨床檢測(cè)評(píng)價(jià)，發(fā)現(xiàn)該法以TC為金標(biāo)準(zhǔn)，其敏感性和特異性分別為98.2%、92.8%，可在90 min內(nèi)出結(jié)果[20]。HDA模仿自然界DNA合成方式，不易引起非特異性擴(kuò)增，具有高敏感性和高保真性。反應(yīng)在同一溫度下可以進(jìn)行，因而不需要昂貴的PCR儀，很適合基層實(shí)驗(yàn)室的使用，為一種嶄新的恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，雖然還有待更進(jìn)一步的探索研究，但是具有很大的發(fā)展前景。

目前NAAT因其敏感性高、快速而被廣泛認(rèn)可，2013年《美國(guó)胃腸病學(xué)雜志》發(fā)表的關(guān)于CDI診斷的指南中指出，建議NAAT可以單獨(dú)作為一種診斷手段[1]。它有利于臨床CDI診治和控制措施的快速開(kāi)展，從而減少經(jīng)驗(yàn)性治療、平均住院時(shí)間、CD傳播的發(fā)生率等，因此可一定程度上降低整體醫(yī)療支出[21]。但在臨床應(yīng)用中仍發(fā)現(xiàn)一些問(wèn)題：難以區(qū)分無(wú)癥狀攜帶者；導(dǎo)致CDI發(fā)病率報(bào)道的增加[22]。因此，建議臨床醫(yī)生把檢測(cè)手段與臨床癥狀相結(jié)合以綜合判斷病情。

4 二步法和三步法

CTA和TC因敏感性高而曾先后推薦為CDI的診斷金標(biāo)準(zhǔn)，但其技術(shù)要求高，耗費(fèi)時(shí)間長(zhǎng)；A/B EIA雖然方便、快速、便宜但敏感性不足；NAAT敏感性高、快速，但費(fèi)用昂貴。因此很多指南推薦二步法和三步法，但關(guān)于該法的具體構(gòu)成存在不一致性。2012年英國(guó)衛(wèi)生部更新的指南建議：使用NAAT或GDH為初篩試驗(yàn)，陽(yáng)性者再加敏感的A/B EIA，全陽(yáng)性考慮CDI；NAAT(GDH)陽(yáng)性，A/B EIA陰性，考慮CD攜帶，有傳染的可能性，可選擇性地再進(jìn)行PCR檢測(cè)；全陰性不考慮CDI。2013年美國(guó)《胃腸病學(xué)雜志》發(fā)表的指南建議，GDH為初篩試驗(yàn)，陰性者排除CDI；陽(yáng)性者必須再進(jìn)行NAAT或A/B EIA檢測(cè)；NAAT陽(yáng)性則考慮CDI，反之排除；A/B EIA陽(yáng)性者考慮CDI，陰性者還需再用NAAT進(jìn)行確診[2]。無(wú)論二步法或三步法構(gòu)造怎樣，其都具有很好的敏感性和特異性[23-24]；雖然確診可能會(huì)稍有延長(zhǎng)，但能夠迅速排除CDI，明顯縮減疾病負(fù)擔(dān)費(fèi)用[25]。見(jiàn)表1。

表1 CDI實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)比較

5 小 結(jié)

CD正在不斷進(jìn)化，CDI的地理范圍、嚴(yán)重程度、發(fā)病特點(diǎn)、人群種類(lèi)也在不斷變化。診斷CDI的檢測(cè)技術(shù)也經(jīng)歷了產(chǎn)毒細(xì)菌分離培養(yǎng)，免疫學(xué)檢測(cè)到分子生物學(xué)技術(shù)檢測(cè)時(shí)代。細(xì)菌分離培養(yǎng)是金標(biāo)準(zhǔn)，但對(duì)標(biāo)本、技術(shù)人員要求高，耗時(shí)長(zhǎng)；免疫學(xué)檢測(cè)快速但是敏感性較低；NAAT則以更敏感、更快速而被大家推崇，雖然費(fèi)用稍高，但是隨著不同的NAAT技術(shù)發(fā)展，費(fèi)用正在逐步降低，有望走向臨床；二步法和三步法同時(shí)具有很好的敏感性和特異性，可針對(duì)性檢測(cè)，從而在整體效益上明顯縮減醫(yī)療費(fèi)用，也有臨床應(yīng)用前景。但是因檢測(cè)到CD產(chǎn)毒基因并不代表CDI，因此CDI診斷需要結(jié)合患者癥狀和其他生化輔助指標(biāo)以綜合評(píng)判患者的病情，以免過(guò)度治療。如何提高CDI診斷率仍將是生物學(xué)工作者及臨床醫(yī)生的一大難題，本綜述對(duì)CDI的診斷技術(shù)進(jìn)行復(fù)習(xí)，希望對(duì)提高CDI的診斷意識(shí)及水平有一些幫助。

[1]Surawicz CM，Brandt LJ，Binion DG，et al.Guidelines for diagnosis,treatment,and prevention of clostridium difficile infections[J].Am J Gastroenterol,2013,108(4):478-498.

[2]Sullivan NM,Pellett S,Wilkins TD.Purification and characterization of toxins A and B of clostridium difficile[J].Infect Immun,1982,35(3):1032-1040.

[3]Lyras D,O′Connor JR,Howarth PM,et al.Toxin B is essential for virulence of clostridium difficile[J].Nature,2009,458(7242):1176-1179.

[4]René P,Frenette CP,Schiller I,et al.Comparison of eight commercial enzyme immunoassays for the detection of clostridium difficile from stool samples and effect of strain type[J].Diagn Microbiol Infect Dis,2012,73(1):94-96.

[5]Polage CR,Chin DL,Leslie JL,et al.Outcomes in patients tested for clostridium difficile toxins[J].Diagn Microbiol Infect Dis,2012,74(4):369-373.

[6]Guerrero DM,Chou C,Jury LA,et al.Clinical and infection control implications of clostridium difficile infection with negative enzyme immunoassay for toxin[J].Clin Infect Dis，2011,53(3):287-290.

[7]Humphriesa RM,Uslanb DZ,Rubinb Z.Performance of clostridium difficile toxin enzyme immunoassay and nucleic acid amplification tests stratified by patient disease severity[J].J Clin Microbiol,2013,51(3):869-873.

[8]Longtin Y,Trottier S,Brochu G,et al.Impact of the type of diagnostic assay on clostridium difficile infection and complication rates in a mandatory reporting program[J].Clin Infect Dis,2013,56(1):67-73.

[9]Foster NF，Riley TV.Improved recovery of clostridium difficile spores with the incorporation of synthetic taurocholate in cycloserine-cefoxitin-fructose agar(CCFA)[J].Pathology,2012,44(4):354-356.

[10]Crobach MJ,Dekkers OM,Wilcox MH,et al.European society of clinical microbiology and infectious diseases(ESCMID):data review and recommendations for diagnosing clostridium difficile-infection(CDI)[J].Clin Microbiol Infect,2009,15(12):1053-1066.

[11]Shetty N,Wren MWD,Coen PG.The role of glutamate dehydrogenase for the detection of clostridium difficile in faecal samples:a meta-analysis[J].J Hosp Infect,2011,77(1):1-6.

[12]Dubberke ER,Han Z,Bobo L,et al.Impact of clinical symptoms on interpretation of diagnostic assays for clostridium diffficile infections[J].J Clin Microbiol,2011,49(8):2887-2893.

[13]Carson KC,Boseiwaqa LV,Thean SK,et al.Isolation of clostridium difficile from faecal specimens-a comparison of chromID C.difficile agar and cycloserine cefoxitin-fructose agar[J].J Med Microbiol,2013,62(9):1423-1427.

[14]Luk S,To WK,Ng TK,et al.A cost-effective approach for detection of toxigenic clostridium difficile:toxigenic culture using chromID clostridium difficile agar[J].J Clin Microbiol,2014,52(2):671-673.

[15]Deshpande A,Pasupuleti V,Rolston DD,et al.Diagnostic accuracy of real-time polymerase chain reaction in detection of clostridium difficile in the stool samples of patients with suspected clostridium difficile infection:a meta-analysis[J].Clin Infect Dis,2011,53(7):81-90.

[16]Persson S,Jensen JN,Olsen KE.Multiplex PCR method for detection of clostridium difficile tcdA,tcdB,cdtA,and cdtB and internal in-frame deletion of tcdC[J].J Clin Microbiol，2011,49(12):4299-4300.

[17]Lalande V,Barrault L,Wadel S,et al.Evaluation of a loop-mediated isothermal amplification assay for diagnosis of clostridium difficile infections[J].J Clin Microbiol,2011,49(7):2714-2716.

[18]Boyanton BL，Sural P，Loomis CR，et al.Loop-mediated isothermal amplification compared to real-time PCR and enzyme immunoassay for toxigenic clostridium difficile detection[J].J Clin Microbiol,2012,50(3):640-645.

[19]Deak E,Miller SA,Humphries RM.Comparison of the illumigene,simplexa,and ampliVue clostridium difficile molecular assays for diagnosis of C.difficile Infection[J].J Clin Microbiol，2014,52(3):960-963.

[20]Buchan BW,Mackey TLA,Daly JA,et al.Multicenter clinical evaluation of the portrait toxigenic C.difficile assay for detection of toxigenic clostridium difficile strains in clinical stool specimens[J].J Clin Microbiol,2012,50(12):3932-3936.

[21]Barbut F,Surgers L,Eckert C,et al.Does a rapid diagnosis of clostridium difficile infection impact on quality of patient management[J].Clin Microbiol Infect,2014,20(2):136-144.

[22]Williamson DA,Basu I,Freeman J,et al.Improved detection of toxigenic clostridium difficile using the cepheid xpert C difficile assay and impact on C difficile infection rates in a tertiary hospital:a double-edged sword[J].Am J Infect Control,2013,41(3):270-272.

[23]Goldenberg SD,Cliff PR,Smith S,et al.Two-step glutamate dehydrogenase antigen real-time polymerase chain reaction assay for detection of toxigenic clostridium difficile[J].J Hosp Infect,2010,74(1):48-54.

[24]Larson AM,Fung AM,Fang FC.Evaluation of tcd real-time PCR in a three-step diagnostic algorithm for detection of toxigenic clostridium difficile[J].J Clin Microbiol,2010,48(1):124-130.

[25]Vasoo S,Stevens J,Portillo L,et al.Cost-effectiveness of a modified two-step algorithm using a combined glutamate dehydrogenase/toxin enzyme immunoassay and real-time PCR for the diagnosis of clostridium difficile infection[J].J Microbiol Immunol Infect,2012,47(1):75-78.

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.08.049

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1672-9455(2015)08-1143-03

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2014-11-22)

△通訊作者，E-mail：fengp_62@163.com。