范建華，徐曼妮(.上海市黃浦區(qū)中心醫(yī)院消化內(nèi)科 200002；2.同濟大學醫(yī)學院預防醫(yī)學教研室，上海 200092)

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GFAP啟動子介導EGFP靶向肝星狀細胞治療肝纖維化的價值探索

范建華1，徐曼妮2△(1.上海市黃浦區(qū)中心醫(yī)院消化內(nèi)科 200002；2.同濟大學醫(yī)學院預防醫(yī)學教研室，上海 200092)

目的 探索體內(nèi)特異性靶向肝星狀細胞(HSC)治療肝纖維化的技術方法。方法 建立四氯化碳誘導的小鼠肝纖維化模型，構建膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)啟動子調(diào)控增強綠色熒光蛋白(EGFP)表達載體，采用尾靜脈高壓注射方法將EGFP表達裸質(zhì)粒轉染到纖維化小鼠的肝臟。熒光顯微鏡觀察EGFP在肝臟的表達及免疫熒光共定位，觀測EGFP與HSC標志蛋白(DESMIN)和α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)的共定位。結果 EGFP與DESMIN和α-SMA共定位說明EGFP主要在HSC中表達，GFAP啟動子能夠調(diào)控外源基因在體內(nèi)靶向HSC。結論 GFAP啟動子介導體內(nèi)靶向HSC，治療肝纖維化策略具有臨床應用的潛力。

膠質(zhì)纖維酸性蛋白啟動子； 增強綠色熒光蛋白； 肝星狀細胞； 肝纖維化

肝纖維化是各種慢性肝病向肝硬化發(fā)展共有的病理改變和必經(jīng)途徑，其是一個復雜的過程，包括肝細胞的凋亡、間質(zhì)細胞的增殖、細胞外基質(zhì)沉積等過程，但其是可逆的，若能及早發(fā)現(xiàn)、積極治療、及時終止和逆轉纖維化的發(fā)生和發(fā)展，則有可能避免肝硬化發(fā)生[1]。諸多研究發(fā)現(xiàn)，肝星狀細胞(HSC)的活化和增殖是肝纖維化發(fā)生的中心環(huán)節(jié)[2]。因此，抑制HSC的激活、增殖與促進HSC凋亡是防治肝纖維化的兩條重要途徑。HSC作為抗纖維治療的靶細胞，已成為目前肝纖維化研究的熱點[3]。但是現(xiàn)在基因治療的探索和嘗試很難在臨床治療上得到應用，一個最主要的原因是抗纖維化因素很難進行特異性的HSC靶向。雖然存在很多困難，近年來靶向HSC的抗纖維化基因治療也有了初步的發(fā)展。一些HSC特異表達基因的啟動子用于調(diào)控外源基因靶向HSC表達[4-5]。其中膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)啟動子被發(fā)現(xiàn)可以用作HSC特異表達的調(diào)控元件，GFAP是一種中間絲蛋白，主要存在于星形細胞內(nèi)，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的星形細胞中特異性高表達，在肝臟的星形細胞中，GFAP也存在特異性的高表達。研究發(fā)現(xiàn)，鼠GFAP啟動子調(diào)控的單純皰疹病毒胸苷激酶基因(HSK-Tk)的轉基因小鼠，用藥物更昔洛韋處理后，能夠特異性地清除小鼠肝臟的HSC[6]。在體外大鼠HSC系 (HSC-T6)的研究發(fā)現(xiàn)，GFAP啟動子調(diào)控的轉化生長因子-β(TGF-β)干擾核糖核酸(RNA)，降低TGF-β表達，從而在信使核糖核酸(mRNA)和蛋白水平上降低膠原的合成[7]。已有研究證明，GFAP啟動子能夠作為調(diào)控外源基因特異性表達的基因治療靶向調(diào)控元件，但是現(xiàn)在的研究大都停留在體外細胞系或是轉基因鼠的研究，考慮到臨床基因治療的作用途徑，需要外源導入抗纖維化藥物。因此在本研究中，作者建立四氯化碳(CCl4)誘導的小鼠肝纖維化模型，激活HSC，構建GFAP啟動子調(diào)控EGFP表達載體，采用尾靜脈高壓注射方法將增強綠色熒光蛋白(EGFP)表達裸質(zhì)粒轉染到纖維化小鼠的肝臟，通過觀察EGFP在肝臟的表達分布，與HSC標志蛋白(DESMIN)和α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)的共定位，探討GFAP啟動子介導體內(nèi)靶向HSC治療策略的可行性。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 細胞系及試驗動物 人HSC系LX-2由其建造者上海中醫(yī)藥大學徐列明教授惠贈，人肝細胞L-02購自中國科學院上海生命科學院細胞庫；Bal/c小鼠購自同濟大學醫(yī)學院實驗動物中心。

1.1.2 主要試劑 DESMIN兔抗體(Cell Signaling,P17661)，α-SMA兔抗體 (Abcam,ab5696)，CY3熒光二抗(美國Earthox熒光二抗，E031620)，HE染色試劑盒(上海百蕊生物科技有限公司)，Masson染色試劑盒(上海杰美基因醫(yī)藥科技有限公司)。

1.2 試驗方法

1.2.1 GFAP啟動子調(diào)控EGFP真核表達載體的構建 提取小鼠肝組織DNA，并以此為模板擴增小鼠基因GFAP啟動子區(qū)5′-DNA序列，擴增引物為上游：5′-CCT CGC TAG C(NheⅠ)TCA CTG CTT ACG CCC AGG TC-3′,reverse:5′-CCT CAA GCT T(HindⅢ)GCG AGC AGC GGA GGT GAT-3′。構建到載體pCDNA3.1的NheⅠ和HindⅢ位點，篩選的陽性克隆經(jīng)過測序確認，構建成載體pCDNA3.1-mGFAP-p。以pEGFP-N1為模板擴增EGFP cDNA序列，擴增引物為上游：5′-CCT GGA TCC(KpnⅠ)AAT GGT GAG CAA GGG CGA-3′，下游：5′-CCT GGA TCC(BamHⅠ)TTA CTT GTA CAG CTC GTC CAT G-3′。插入到pCDNA3.1-mGFAP-p的KpnⅠ和BamHⅠ位點，測序確定，構建成GFAP啟動子調(diào)控EGFP的真核生物表達載體pCDNA3.1-mGFAP-p-EGFP。

1.2.2 EGFP在體外細胞系的表達驗證 LX-2、L-02細胞用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。將對數(shù)生長期的細胞消化鋪板24孔板，鋪板24 h后，細胞的生長密度大約為60%，用轉染試劑lipo2000轉染pCDNA3.1-mGFAP-p-EGFP及對照質(zhì)粒pCDNA3.1-mGFAP-p，轉染質(zhì)粒的用量為0.8微克/孔，轉染后的48 h，細胞置于熒光顯微鏡下觀察。

1.2.3 CCl4誘導建立小鼠肝纖維化模型 試驗動物BALB/c小鼠20只，每只小鼠的重量大約為16～18 g，試驗小鼠分四組，分別為正常組(normal，N)、模型組(model，M)、對照組(control，C)及試驗組(treatment，T)，每組5只小鼠。每只小鼠每3天進行1次腹腔注射，模型組、對照組和試驗組注射橄欖油稀釋的CCl4溶液(按體積比，CCl4∶橄欖油=1∶4)，第一次注射量為0.5 mL/kg小鼠,隨后每次注射量為0.25 mL/kg小鼠。正常組注射同樣量的橄欖油。CCl4處理4周后，取肝組織進行肝纖維化檢測。

1.2.4 尾靜脈高壓注射法導入表達質(zhì)粒 pCDNA3.1-mGFAP-p-EGFP及對照質(zhì)粒pCDNA3.1-mGFAP-p采用尾靜脈高壓注射法導入小鼠的肝組織，具體步驟為：質(zhì)粒用磷酸鹽緩沖液(PBS)溶解，濃度為50 μg/mL，注射體積為1.6 mL/20 g小鼠，注射在5 s內(nèi)完成；正常組和模型組注射同樣劑量的磷酸鹽緩沖液PBS。每5天進行1次尾靜脈注射，試驗組注射GFAP啟動子調(diào)控的EGFP表達載體pCDNA3.1-GFAP-p-EGFP，對照組注射陽性對照質(zhì)粒pCDNA3.1-GFAP-p。注射4周后，取小鼠肝組織進行檢測。

1.2.5 制備小鼠的肝組織切片 小鼠采用脫頸法處死，迅速剖取肝臟，將肝臟右葉從中部縱向切開，從切面處取1.0 cm×1.0 cm×0.2 cm兩塊組織，一塊置于4%多聚甲醛溶液4 ℃固定，以備石蠟切片的制備；另一塊放入組織凍存液中液氮凍存，以備冷凍切片的制備。試驗操作過程確保每只小鼠的取樣部位盡量相同。

1.2.6 小鼠的肝組織切片HE染色 染色前用二甲苯脫去切片中的石蠟，再經(jīng)由高濃度到低濃度乙醇，最后入蒸餾水，即可開始染色。將已入蒸餾水后的切片放入蘇木精水溶液中染色數(shù)分鐘，酸水及氨水中分色，各數(shù)秒鐘，流水沖洗1 h后入蒸餾水片刻。入70%和90%乙醇中脫水各10 min。入乙醇伊紅染色液染色2～3 min，染色后的切片經(jīng)乙醇脫水，再經(jīng)二甲苯使切片透明，透明處理過的切片加上中性樹膠，蓋上蓋玻片封固，于光鏡觀察。

1.2.7 小鼠的肝組織切片Masson染色 小鼠肝組織石蠟切片按常規(guī)方法脫蠟，經(jīng)Weigert鐵蘇木素染色8 min，流水沖洗,置于1%鹽酸乙醇分化2 min，用流水沖洗數(shù)分鐘，隨后麗春紅酸性品紅染色8 min，蒸餾水稍洗，再經(jīng)磷鉬酸溶液處理5 min，此時勿洗,直接用苯胺藍復染5 min，然后經(jīng)1%冰醋酸處理1 min或自來水漂洗，最后經(jīng)95%乙醇、無水乙醇脫水，二甲苯透明，用中性樹膠封片，于光鏡下觀察。

1.2.8 纖維化程度統(tǒng)計分析 對照組和CCl4處理組小鼠肝臟石蠟切片進行Masson染色，肝纖維化程度表示為藍色染色區(qū)域(膠原)占整個視野的百分比。所用的圖像分析系統(tǒng)為：Motic Images Advanced3.2，對每張切片隨機選擇5個視野(光鏡200倍)進行分析，測量藍色區(qū)域占視野百分比。

1.2.9 免疫熒光檢測 取小鼠冷凍肝組織，用冷凍切片機切成厚度為7 μm的切片，置5%的多聚甲醛溶液中固定10 min后；去固定液，搖床輕晃洗滌3次，每次3～5 min；用封閉液封閉60 min，去封閉液，加入DESMIN兔抗體、α-SMA兔抗體一抗4 ℃作用過夜；去除一抗，用洗滌液洗滌3～5次，每次3～5 min，去除洗滌液，加入1 mL稀釋好的CY3熒光標記羊抗兔的二抗，作用60 min；用洗滌液洗滌3～5次，每次3～5 min。加入4′，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染液1 mL作用5 min，去除DAPI染液，用洗滌液洗滌3～5次，每次3～5 min，熒光顯微鏡下觀察，拍照。

1.3 統(tǒng)計學處理 結果采用SPSS16.0軟件進行t檢驗分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 GFAP啟動子調(diào)控EGFP在體外細胞系特異表達 為確定GFAP啟動子特異調(diào)控EGFP在HSC的表達，作者通過瞬時轉染pCDNA3.1-mGFAP-p-EGFP及對照質(zhì)粒pCDNA3.1-mGFAP-p到LX-2和L-02細胞，通過熒光顯微鏡觀察綠色熒光蛋白在細胞的表達，結果發(fā)現(xiàn)，轉染陰性對照質(zhì)粒pCDNA3.1-mGFAP-p的LX-2和L-02幾乎沒有綠色熒光。轉染pCDNA3.1-mGFAP-p-EGFP的LX-2細胞比L-02細胞綠色熒光更強，見圖1。

圖1 EGFP在LX-2、L-02細胞表達

2.2 CCl4誘導肝纖維化小鼠模型檢測

2.2.1 HE染色觀察小鼠肝臟病理變化 小鼠肝組織石蠟切片HE染色結果顯示：N組小鼠肝臟柔軟、紅潤、被膜光滑；肝細胞排列規(guī)則成索狀，在中央靜脈周圍呈放射狀分布；肝血竇結構清晰，無異常改變；肝細胞呈多邊形，胞漿均勻，細胞核形態(tài)正常。注射CCl4組小鼠肝臟體積有所增大，部分的肝表面有直徑約1 mm的點狀白斑。匯管區(qū)和部分間質(zhì)內(nèi)彌漫性淋巴細胞浸潤，匯管區(qū)附近有明顯的壞死灶，見圖2。

圖2 肝組織HE染色(×40)

2.2.2 Masson染色顯示肝組織纖維化病理性改變 Masson染色后的切片，膠原被染成藍色，顯微鏡下觀察，200倍下發(fā)現(xiàn)正常組小鼠的肝組織細胞排列整齊，肝小葉清晰可見，藍色染色區(qū)域面積很少且主要集中在匯管區(qū)。CCl4處理組小鼠藍色染色區(qū)域在匯管區(qū)及肝組織內(nèi)部明顯增多，分布雜亂，可見假小葉，見圖3。

圖3 肝組織Masson染色(×200)

2.2.3 纖維化程度統(tǒng)計分析 對照組和CCl4處理組小鼠肝臟石蠟切片平均纖維化區(qū)域分別為5.12%和43.5%(P<0.05)。結果顯示，CCl4處理組Masson染色程度明顯高于正常組小鼠，說明對照組與CCl4處理組小鼠肝臟纖維程度比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

2.3 GFAP啟動子介導EGFP在肝纖維化小鼠HSC的特異表達

2.3.1 EGFP在肝組織中的表達檢測 熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，與注射pCDNA3.1-mGFAP-p對照組比較，注射pCDNA3.1-mGFAP-p-EGFP試驗組的肝組織切片中分布明顯的綠色熒光，說明尾靜脈高壓注射后將裸質(zhì)粒轉導入肝臟，并且證實真核表達質(zhì)粒pCDNA3.1-mGFAP-p-EGFP在肝臟內(nèi)表達，見圖4。

圖4 肝組織的熒光表現(xiàn)(×100)

2.3.2 EGFP在HSC中特異表達 筆者用免疫熒光共定位試驗對小鼠的冰凍切片進行EGFP和HSC共定位檢測。靜止HSC特異表達標志基因DESMIN以及活化HSC的特異表達標志基因α-SMA作為示蹤蛋白用紅色熒光指示。結果顯示注射pCDNA3.1-mGFAP-p-EGFP質(zhì)粒的試驗組小鼠的EGFP綠色熒光分別與代表DESMIN和α-SMA的紅色熒光相互重疊。結果說明由于GFAP啟動子的特異性調(diào)控，通過尾靜脈注射轉染到肝臟的質(zhì)粒，主要在HSC中表達，見圖5。

圖5 EGFP與DESMIN和α-SMA的共定位

3 討 論

慢性肝病大多數(shù)都有肝纖維化，其中25%～40%最終發(fā)展成肝硬化乃至肝癌。阻斷肝纖維化成為慢性肝病治療的一個關鍵問題。目前肝纖維化動物模型的建模方法包括化學藥物刺激、免疫法以及膽管結扎等，CCl4誘導小鼠肝纖維化是經(jīng)典動物模型[8]。本研究通過間隔腹腔注射CCl4誘導肝纖維化，通過HE與Masson染色檢測炎性反應及膠原合成，確定肝纖維化模型是否建立成功。結果表明CCl4注射組的小鼠炎性反應程度及膠原合成顯著高于正常組，說明本試驗肝纖維化模型的建立是成功的。另外，HE染色也證明正常小鼠肝臟內(nèi)部沒有炎性反應、肝小葉排列正常，說明CCl4的溶解液(橄欖油)和質(zhì)粒的緩沖液，腹腔注射及尾靜脈高壓注射等實驗操作不影響纖維化的發(fā)生。

成纖維細胞是肝纖維化細胞外基質(zhì)的主要來源細胞，HSC是肌成纖維細胞的主要來源細胞[9]。目前抗纖維化基因治療有了初步發(fā)展，但基因治療缺乏細胞選擇性，可能會引起其他組織細胞的損害。為了減少不良反應，必須選擇目的基因在肝臟HSC中特異表達的方法。目前有TIMP1、CSRP2、SM22alpha啟動子能使基因在HSC中特異表達，但仍不夠理想[10]。近來GFAP被認為是HSC特異表達的標志蛋白。因此，本研究采用尾靜脈高壓注射裸質(zhì)粒的方法將pCDNA3.1-mGFAP-p-EGFP瞬時轉染到肝纖維化小鼠肝臟中。這種轉染方法是一種有效的、肝臟特異性的基因轉移方法，通過瞬時注射大劑量的裸質(zhì)粒將外源基因轉染到動物的肝組織，裸質(zhì)粒在肝細胞內(nèi)瞬時表達，不會對肝臟產(chǎn)生長期干擾，已廣泛用于外源基因的表達變化對肝臟疾病發(fā)生、發(fā)展影響的研究[11]。通過熒光顯微鏡檢測EGFP綠色熒光驗證轉染效果，轉染pCDNA3.1-mGFAP-p-EGFP質(zhì)粒的小鼠肝臟綠色熒光強度顯著高于轉染pCDNA3.1-mGFAP-p對照質(zhì)粒的小鼠，說明GFAP啟動子能使EGFP在肝臟組織中高效表達。EGFP與星狀細胞標志蛋白共定位實驗結果顯示，綠色熒光的EGFP與顯示為紅色熒光的DESMIN和α-SMA大部分重合在一起，說明EGFP主要在HSC中表達，進一步提示GFAP啟動子能夠調(diào)控外源基因可以在體內(nèi)靶向HSC，因此，GFAP啟動子介導體內(nèi)靶向HSC治療策略具有臨床應用的潛力。

[1]Liu X，Xu J，Brenner DA，et al.Reversibility of liver fibrosis and inactivation of fibrogenic myofibroblasts[J].Curr Pathobiol Rep,2013,1(3):209-214.

[2]Tacke F,Weiskirchen R.Update on hepatic stellate cells:pathogenic role in liver fibrosis and novel isolation techniques[J].Expert Rev Gastroenterol Hepatol，2012，6(1):67-80.

[3]Su TH,Kao JH,Liu CJ.Molecular mechanism and treatment of viral hepatitis-related liver fibrosis[J].Int J Mol Sci,2014,15(6):10578-10604.

[4]Cheng K，Yang NN，Mahato RI.TGF-β1gene silencing for treating liver fibrosis[J].Mol Pharm,2009,6(3):772-779.

[5]Chen SW，Chen YX，Zhang XR,et al.Targeted inhibition of platelet-derived growth factor receptor-beta subunit in hepatic stellate cells ameliorates hepatic fibrosis in rats[J].Gene Therapy,2008,15(21):1424-1435.

[6]Puche JE，Lee YA，Jiao J，et al.A novel murine model to deplete hepatic stellate cells uncovers their role in amplifying liver damage in mice[J].Hepatology,2013,57(1):339-350.

[7]Yang NN,Mahato RI.GFAP promoter-driven RNA interference on TGF-β1to treat liver fibrosis[J].Pharm Res,2011,28(4):752-761.

[8]Weiler-Normann C,Herkel J,Lohse AW.Mouse models of liver fibrosis[J].Z Gastroenterol,2007,45(1):43-50.

[9]Fallowfield JA.Therapeutic targets in liver fibrosis[J].Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol,2011,300(5):709-715.

[10]Herrmann J,Arias M,Van De Leur E,et al.CSRP2,TIMP-1,and SM22alpha promoter fragments direct hepatic stellate cell-specific transgene expression in vitro，but not in vivo[J].Liver Int,2004,24(1):69-79.

[11]Xu W，Wang LW，Shi JZ，et al.Effects of RNA interference targeting transforming growth factor-beta 1 on immune hepatic fibrosis induced by Concanavalin A in mice[J].Hepatobiliary Pancreat Dis Int,2009,8(3):300-308.

The value of treatment to hepatic fibrosis with GFAP promoter directs EGFP targeting to hepatic stellate cell

FANJian-hua1，XUMan-ni2△

(1.DepartmentofGastroenterology，HuangpuDistractCenterHospital，Shanghai200002，China；2.DepartmentofPreventionMedicine，TongjiUniversity，Shanghai200092，China)

Objective To find the possibility that the glial fibrillary acidic protein (GFAP) promoters modulate the exogenous gene specific expression in HCS for hepatic fibrosis treatment.Methods Established a model of carbon tetrachloride-induced hepatic fibrosis in mice.pCDNA3.1-mGFAP-p-EGFP plasmid was constructed and injected into mice liver by hydrodynamics based transfection method.EGFP expression in the liver was observated under Fluorescence microscopy to evaluate the efficiency of GFAP promoter.The co-expressions of EGFP with DESMIN and α-SMA was detected by immunofluorescence.Results The expression of EGFP in liver driven by GFAP promoter was co-localized with HCS specific markers such as DESMIN and α-SMA.Illustrated that GFAP promoter could drive EGFP specific expression in HSCS but not in hepatocytes of liver fibrosis murine.Conclusion These observation demonstrate that GFAP promoter could in vivo regulate expression of target gene in HSC,offering a useful tool for gene therapy against hepatic fibrosis.

glial fibrillary acidic protein promoter； enhanced green fluorescent protein； hepatic stellate cells； hepatic fibrosis

范建華，女，主治醫(yī)師，碩士，主要從事消化系統(tǒng)疾病基礎及臨床研究。

△通訊作者，E-mail：xmann@sohu.com。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.08.017

A

1672-9455(2015)08-1070-04

2014-11-15

2014-12-10)