徐國鑫，李效尊，楊百戰(zhàn)，杜紹印，尹靜靜，吳修

（1.山東省水稻研究所/山東省農業(yè)科學院水生生物研究中心，濟南，250100；2.郯城縣種子公司）

荸薺（Eleocharis dulcis，Eleocharis tuberosa），又名馬蹄、地栗、烏芋等，是莎草科荸薺屬多年生草本植物，原產印度和中國南方地區(qū)[1]。荸薺球莖表皮呈紅褐色至黑褐色，肉質細嫩、清脆爽口；其營養(yǎng)成分豐富，每100 g 鮮品中含碳水化合物21.8 g、蛋白質1.5 g、脂肪0.1 g、粗纖維0.5 g[2]。目前，我國荸薺總種植面積約5 萬hm2，分布于華北、華東、華南等多個省份；在山東濟寧、臨沂、棗莊、泰安等地區(qū)均有種植。

荸薺球莖一般在秋季形成并膨大，在膨大中后期積累大量淀粉作為貯藏物質。目前針對荸薺的研究主要集中于種質資源、栽培技術、組培快繁和生理生化等方面，關于球莖膨大機理的研究比較缺乏[3]。朱世東[4]研究表明，荸薺球莖膨大約需70 d，經歷一個“快—慢—快”的過程：膨大前期（1～20 d）球莖生長速度快、膨大中期（21～40 d）生長速度減緩、膨大后期（41～70 d）生長速度再次加快[4,5]。施國新等[6]利用石蠟切片技術，發(fā)現(xiàn)球莖膨大早期薄壁細胞進行有絲分裂，細胞橫截面積增大；淀粉粒首先從球莖基部中央的薄壁細胞開始積累，然后推向球莖頂部和周圍細胞[6]。

樹脂切片技術廣泛應用于生命科學研究，與石蠟切片相比，樹脂切片能夠更加完整和清晰地顯示細胞的微觀結構。本研究利用樹脂切片結合組織化學技術，清晰地顯示出荸薺球莖不同發(fā)育時期的細胞形態(tài)，分析了淀粉粒的分布和積累規(guī)律，同時觀察了球莖表皮及皮層細胞的結構特點，加深了對荸薺球莖膨大機理的理解。

1 材料與方法

1.1 供試材料

野生荸薺品種采集于山東郯城縣，種植于山東省農業(yè)科學院飲馬泉試驗基地。于2014 年8～9 月，采取發(fā)育早期（膨大10 d）、發(fā)育中期（膨大30 d）和發(fā)育后期（膨大50 d）的球莖。

1.2 試驗方法

b.席夫（Schiff）試劑。稱取0.5 g 堿性品紅，加入100 mL 蒸餾水，沸水浴加熱溶解5 min，冷卻至室溫后經濾紙過濾，加入1 g 偏亞硫酸氫鈉和2 mL濃鹽酸，充分混勻后避光密封保存。約24 h 后，試劑變成淺黃色即可使用。

c.改良甲苯胺藍染色液。稱取0.5 g 甲苯胺藍，加入100 mL 30%的乙醇，加熱至65℃，攪拌30 min，過濾后避光保存。

d.制片與染色。樹脂切片制作參照Wei 等[7]的方法。染色方法參考Bronner 等[8]的方法，并進行改進。將載玻片浸入0.4%（W/W）的高碘酸鉀溶液中氧化20 min，自來水沖洗，蒸餾水浸洗3 次，每次2 min；浸入Schiff 試劑中染色20 min，自來水沖洗，蒸餾水浸洗2 次，每次1 min。將載玻片浸入改良甲苯胺藍染色液中，染色2 min，自來水沖洗，蒸餾水浸洗2次，每次1 min，35℃烘干。中性樹膠封片，顯微鏡觀察拍照。

圖1 荸薺球莖的膨大過程

圖2 荸薺球莖不同發(fā)育時期薄壁細胞結構

2 結果與分析

2.1 荸薺球莖發(fā)育過程形態(tài)變化

荸薺球莖膨大10 d 時，直徑約10 mm，表皮為白色；膨大至30 d 時，直徑約20 mm，表皮顏色略有加深；膨大至50 d 時，直徑約30 mm，表皮開始變?yōu)楹稚▓D1）。

2.2 球莖膨大過程淀粉粒積累和細胞結構變化

在顯微鏡下觀察染色后的切片，可以看到淀粉粒被染成紅色，細胞壁及細胞核等結構被染成淺藍色至藍黑色（圖2）。球莖的薄壁細胞含有較大的液泡，淀粉粒由于受到液泡的擠壓分布于細胞邊緣（圖2D）。伴隨著球莖的膨大，薄壁細胞中的淀粉粒數(shù)目增多、體積增大，薄壁細胞的橫截面積也顯著增大（圖2A、C）。在球莖膨大10 d 和30 d 時，薄壁細胞中的細胞核結構清晰，呈橢球形，內有黑色的核仁（圖2D、E）；膨大至50 d 時，由于淀粉粒大量積累，細胞核被擠壓成不規(guī)則形（圖2F）。

圖3 球莖膨大中期和后期表皮細胞形態(tài)

圖4 皮層細胞結構

在球莖膨大過程中，表皮細胞的形態(tài)也發(fā)生明顯變化，其橫截面長度由約15 μm（圖3A）拉伸到約50 μm（圖3B）。另外，在表皮細胞下方是皮層細胞，由12～15 層薄壁細胞組成；皮層細胞與內側基本組織之間存在2 層較小的細胞（圖4），在切片制備的過程中，這2 層細胞容易與球莖內側的組織分離（圖4B），其功能尚不清楚。皮層細胞中散落分布一些橢球形的分泌細胞，其液泡內部含有的物質被染為橙色（圖4），內含物成分尚不明確。

3 討論與結論

根據(jù)已有的研究結果，荸薺球莖在發(fā)育后期體積迅速增大，干物質含量迅速增加[4]。通過比較球莖發(fā)育后期（膨大50 d）和中期（膨大30 d）的細胞結構，發(fā)現(xiàn)膨大50 d 時，薄壁細胞中的淀粉粒大量積累、互相擠壓，占據(jù)細胞內較多的空間，甚至影響了細胞核的形態(tài)，這說明淀粉積累是球莖干物質含量增加的主要因素。此外，研究發(fā)現(xiàn)為適應球莖發(fā)育后期的迅速膨大，表皮細胞的長度被拉伸數(shù)倍，說明球莖表面積的增加主要是通過表皮細胞的伸展，而不是表皮細胞數(shù)目的增加。

現(xiàn)代醫(yī)學認為，荸薺有抗腫瘤、抗菌、防治呼吸道疾病、清肺化痰等作用[2]，荸薺的藥用功效可能與荸薺皮中的甾醇、多糖和酯類等多種活性成分有關[9～13]。研究發(fā)現(xiàn)荸薺球莖的皮層細胞間分布有橙色的分泌細胞，分泌細胞可能是上述活性成分的存儲部位，因此進一步探明分泌細胞的物質成分和積累規(guī)律，有助于提高荸薺皮的資源利用效率。

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