何家全 楊忠 蔡文琴

（1.川北醫(yī)學(xué)院第二臨床醫(yī)學(xué)院·南充市中心醫(yī)院神經(jīng)外科，四川南充637000；2.第三軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)部組織胚胎學(xué)教研室，重慶400038）

視神經(jīng)是視覺傳導(dǎo)的通路，屬中樞神經(jīng)，由視網(wǎng)膜節(jié)細(xì)胞發(fā)出的神經(jīng)纖維及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞組成，不含神經(jīng)元胞體，因此常用作中樞神經(jīng)損傷再生研究較理想的實(shí)驗(yàn)材料［1、2］，但有關(guān)不同發(fā)育階段大鼠視神經(jīng)的變化目前還未見系統(tǒng)報(bào)道。本研究從組織形態(tài)學(xué)的角度，采用常規(guī)HE及免疫組織化學(xué)染色，結(jié)合電鏡技術(shù)，通過對不同發(fā)育階段大鼠視神經(jīng)的觀察，以期揭示其變化規(guī)律，為進(jìn)一步進(jìn)行有關(guān)視神經(jīng)的研究提供實(shí)驗(yàn)資料。

1 材料和方法

1.1 動物及主要試劑來源 實(shí)驗(yàn)動物由第三軍醫(yī)大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心提供成年Wistar品系大鼠，種鼠按雄：雌1∶2籠養(yǎng)交配，次晨檢查出現(xiàn)陰栓為妊娠零天。實(shí)驗(yàn)試劑為抗CNPase單抗（2′3′－cyclic nucleotide 3′－phosphohydrolase，CNPase，Promega公司）用于標(biāo)記整個(gè)發(fā)育階段的少突膠質(zhì)細(xì)胞，抗GalC（Galactocerebroside GalC，Sigma公司）多抗用于標(biāo)記成熟的少突膠質(zhì)細(xì)胞?？鼓z質(zhì)纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP，重慶醫(yī)科大學(xué)）單抗用于標(biāo)記星形膠質(zhì)細(xì)胞。SP免疫組化試劑盒為北京中山公司產(chǎn)品。

1.2 分組與檢測方法

1.2.1 動物分組及取材 按產(chǎn)后（postnatal）0、3、5、8、15、20、90天平均分成7組，分別命名為P0d、P3d、P5d、P8d、P15d、P20d及P90d，每組4只。其中HE染色、抗CNPase、GalC和GFAP免疫組化染色2只，電鏡2只。動物斷頭后1分鐘內(nèi)用顯微手術(shù)器械于視交叉向前一直達(dá)眼球完整取出視神經(jīng)。電鏡標(biāo)本放入3%的戊二醛中固定，HE及免疫組化染色標(biāo)本放入4%的多聚甲醛／PB中固定，常規(guī)石蠟包埋切片。

1.2.2 免疫組化染色觀察 操作步驟按說明書進(jìn)行，只作少許修改，即石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，3% H2O2／甲醇10min，PBS洗3min×3次，7%山羊血清／PBS室溫孵育30min，CNPase（1∶1000）單抗，GalC多抗（1∶100）及GFAP單抗（1∶100）4℃過夜，PBS洗5min×3次，生物素化IgG（1∶200）37℃6h，PBS 5min ×3次，HRP標(biāo)記的鏈霉卵白素（1∶200）37℃2h，PBS 5min×3次后，DAB顯色光鏡觀察。

1.2.3 發(fā)育大鼠視神經(jīng)HE染色按常規(guī)進(jìn)行電鏡觀察、常規(guī)包埋后切片，電子染色，透射電鏡觀察。將HE染色及GFAP和CNPase、GalC染色結(jié)果照相，然后換算成相同放大倍數(shù)（×200），每張照片（5吋）分別隨機(jī)統(tǒng)計(jì)4個(gè)相同面積（4cm2）內(nèi)陽性細(xì)胞數(shù)，每種染色在相同時(shí)相點(diǎn)統(tǒng)計(jì)兩張照片（n＝8），統(tǒng)計(jì)時(shí)按照體視學(xué)的原則，對于統(tǒng)計(jì)格內(nèi)框格線上的細(xì)胞進(jìn)行數(shù)上不數(shù)下，數(shù)左不數(shù)右；HE染色切片則統(tǒng)計(jì)相同情況下藍(lán)染細(xì)胞核的數(shù)目，以此作為視神經(jīng)內(nèi)膠質(zhì)細(xì)胞的總數(shù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 所得數(shù)據(jù)用SPMR數(shù)理統(tǒng)計(jì)程序包在計(jì)算機(jī)進(jìn)行雙因素方差分析，所用程序?yàn)镸ANOVA，結(jié)果以±s標(biāo)準(zhǔn)差表示，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 電鏡觀察 大鼠出生后1天的視神經(jīng)內(nèi)細(xì)胞排列不規(guī)則，核多呈圓形，有的細(xì)胞內(nèi)胞漿較豐富，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體及高爾基氏體較發(fā)達(dá)，異染色質(zhì)相對較多；另有一些細(xì)胞質(zhì)內(nèi)電子密度相對較低，有時(shí)可見成束的膠質(zhì)原纖維，細(xì)胞核相對較大，異染色質(zhì)相對較少，此類細(xì)胞相對較前一類為多。細(xì)胞間有大量的軸突，不見明顯的髓鞘形成。出生后3天，細(xì)胞的數(shù)量有所增加，細(xì)胞的排列趨于規(guī)則，即細(xì)胞沿視神經(jīng)長軸平行排列，與纖維相間。胞體稍有增大，胞質(zhì)內(nèi)細(xì)胞器仍較豐富，異染色質(zhì)較多的細(xì)胞比例有所增加，軸突似可見單層的髓鞘。出生后5天，異染色質(zhì)較多的細(xì)胞明顯增多，細(xì)胞排列更規(guī)則，胞質(zhì)顯著減少，胞核拉長變扁，纖維區(qū)出現(xiàn)散在髓鞘包繞的軸突（見圖1）。以后這種變化越來越明顯，到出生后3月，可見細(xì)胞體積相對較小，胞質(zhì)內(nèi)仍可見較多的高爾基氏體和豐富的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)；細(xì)胞核長方形，常偏位；軸突均為髓鞘所包繞，已少見到胞質(zhì)內(nèi)有膠質(zhì)原纖維的細(xì)胞，見圖2。

圖1 出生后5天大鼠視神經(jīng)電鏡示散在髓鞘形成（×5K）Figure 1 Partial myelination of optic nerve 5 days postnatal

圖2 出生后3月大鼠視神經(jīng)電鏡示髓鞘形成完成（×20K）Figure 2 Completed myelination of optic nerve 3 months postnatal

2.2 HE染色光鏡觀察 大鼠出生后1天，視神經(jīng)組織內(nèi)細(xì)胞散在，較少，排列不規(guī)則；出生后3天，細(xì)胞數(shù)量明顯增多（見圖3）；出生后5天，細(xì)胞排列漸規(guī)則，細(xì)胞數(shù)量的增幅明顯減??；至出生20天后細(xì)胞排列規(guī)則，見圖4。

圖3 HE染色示出生后3天大鼠視神經(jīng)內(nèi)細(xì)胞數(shù)明顯增加（×200）Figure 3 Obviously increased cell number of optic nerve 3 days postnatal

圖4 HE染色示成年大鼠視神經(jīng)內(nèi)細(xì)胞數(shù)顯著增多（×200）Figure 4 Significant increase of cell number in adult rats

2.3 CNPase及GalC免疫組化染色 大鼠出生后1天，視神經(jīng)內(nèi)均未見GalC免疫染色陽性細(xì)胞，而只有極少數(shù)的CNPase免疫反應(yīng)陽性細(xì)胞，排列不規(guī)則（見圖5）。到出生后5天，兩種抗體均為陽性的細(xì)胞數(shù)已顯著增多，排列也趨于規(guī)則，于出生后15天，細(xì)胞數(shù)量的增長已顯著放慢，并沿視神經(jīng)的長軸平行排列，見圖6。

2.4 GFAP免疫組化染色 大鼠出生后前3天，有較多的GFAP免疫反應(yīng)陽性細(xì)胞（見圖7），8天后，GFAP免疫反應(yīng)陽性細(xì)胞數(shù)量較新生大鼠顯著減少，到出生后3月，GFAP免疫反應(yīng)陽性細(xì)胞已較少見到，見圖8。

圖5 GalC免疫組化染色示新生大鼠視神經(jīng)內(nèi)少突膠質(zhì)細(xì)胞極少（× 200）Figure 5 Few oligodendrocyte in the optic nerve of newborn rat

圖6 GalC免疫組化染色示成年大鼠視神經(jīng)內(nèi)少突膠質(zhì)細(xì)胞多（× 200）Figure 6 Large Number oligodendrocyte in the optic nerve of adult rat

圖7 GFAP免疫組化染色示新生大鼠視神經(jīng)內(nèi)星形膠質(zhì)細(xì)胞較多（×200）Figure 7 More astrocyte in the optic nerve of newborn rat

圖8 GFAP免疫組化染色示成年大鼠視神經(jīng)內(nèi)星形膠質(zhì)細(xì)胞極少（× 200）Figure 8 Few astrocyte in the optic nerve of adult rat

2.5 不同發(fā)育階段視神經(jīng)內(nèi)兩種大膠質(zhì)細(xì)胞的統(tǒng)計(jì)學(xué)變化 大鼠出生后3天，視神經(jīng)內(nèi)細(xì)胞總數(shù)較出生時(shí)有顯著增加（P＜0.05），以后其增加速度迅速減慢，但成年大鼠視神經(jīng)內(nèi)的細(xì)胞數(shù)較出生后20天仍有一定程度的增長。CNPase免疫反應(yīng)陽性細(xì)胞在出生后3天顯著增加（P＜0.05），同時(shí)，GalC免疫反應(yīng)陽性細(xì)胞也迅速增加（P＜0.05），到出生后20天，相同面積內(nèi)CNPase免疫反應(yīng)陽性細(xì)胞數(shù)與GalC免疫反應(yīng)陽性細(xì)胞數(shù)已無顯著差別（P＞0.05）。相反，GFAP免疫反應(yīng)陽性細(xì)胞雖然在出生后3天有一定程度的增加，但出生5天后其數(shù)量即迅速減少，至成年后便維持在一定水平，見表1

3 討論

中樞神經(jīng)系統(tǒng)膠質(zhì)細(xì)胞的分類復(fù)雜，根據(jù)其大小、形態(tài)、功能及免疫學(xué)特性就可分為很多種。其中兩種大膠質(zhì)細(xì)胞，少突膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中所占的比例最大，且生物學(xué)作用也非常重要。因此，本研究主要就這兩種膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行了觀察。

表1 發(fā)育大鼠視神經(jīng)內(nèi)各細(xì)胞成分相對數(shù)量的變化Table 1 Changes of the cell number of optic nerve in the developmental rats

目前，鑒定星形膠質(zhì)細(xì)胞及少突膠質(zhì)細(xì)胞的方法也有多種，包括光鏡及電鏡方法。電鏡對組織結(jié)構(gòu)的細(xì)微變化觀測有著不可替代的優(yōu)越性，通過對電鏡下某些細(xì)胞所表現(xiàn)出的特征性結(jié)構(gòu)的認(rèn)識，可以達(dá)到對這些細(xì)胞進(jìn)行初步定性的目的［3］。而在光鏡下，免疫組化染色不僅可對細(xì)胞進(jìn)行較準(zhǔn)確的定性，從而對細(xì)胞進(jìn)行較準(zhǔn)確的分類計(jì)數(shù)，而且在一定程度上還可對細(xì)胞內(nèi)某些代射產(chǎn)物進(jìn)行定量檢測。本研究正是基于這樣的事實(shí)，綜合運(yùn)用常規(guī)HE染色、免疫組化及電鏡技術(shù)，對不同發(fā)育階段大鼠視神經(jīng)進(jìn)行了比較系統(tǒng)的觀察。

本研究結(jié)果顯示，新生大鼠的視神經(jīng)內(nèi)可見大量平行排列的視網(wǎng)膜節(jié)細(xì)胞軸突，不見明顯的髓鞘形成，其髓鞘是在出生后5天才逐漸形成的，這與Schwab等（1989）在皮質(zhì)脊髓束中觀察到的基本一致。視神經(jīng)中各細(xì)胞成份的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯示，視神經(jīng)中相同面積內(nèi)的細(xì)胞總數(shù)在出生后的最初3天變化比較明顯，即在出生后3天之內(nèi)，細(xì)胞總數(shù)迅速增加，以后則變化明顯放慢。同時(shí)，視神經(jīng)中兩種主要的細(xì)胞成份少突膠質(zhì)細(xì)胞及星形膠質(zhì)細(xì)胞的數(shù)量各自向著相反的方向變化，即在較短的時(shí)間內(nèi)少突膠質(zhì)細(xì)胞的數(shù)量迅速增加，而星形細(xì)胞的數(shù)量迅速減少。在出生后3天，視神經(jīng)中不僅CNPase免疫反應(yīng)陽性細(xì)胞數(shù)迅速增加，而且還出現(xiàn)了較多GalC免疫反應(yīng)陽性細(xì)胞（P＜0.05），這種GalC免疫反應(yīng)陽性細(xì)胞隨著視神經(jīng)的發(fā)育成熟，其比例也逐漸接近CNPase免疫反應(yīng)陽性細(xì)胞，也就是說，視神經(jīng)不斷發(fā)育成熟伴隨著少突膠質(zhì)細(xì)胞的發(fā)育成熟［5，6］。

早些時(shí)候Jakson［7］及Dentinger［8］等采用先在光鏡下數(shù)單位面積內(nèi)細(xì)胞的總數(shù)，再在電鏡下鑒定細(xì)胞類型的方法對發(fā)育大鼠視神經(jīng)內(nèi)各細(xì)胞成份的變化進(jìn)行了類似的研究。其結(jié)論是：視神經(jīng)在出生后的發(fā)育中細(xì)胞的總數(shù)有逐漸減少的頃向，并認(rèn)為少突膠質(zhì)細(xì)胞的比例在出生后雖迅速增加，但星形細(xì)胞卻終保持著較高的比例，在成年動物差不多為1∶1，這與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果有較大的偏差。Burne等［9］直接在電鏡下進(jìn)行細(xì)胞分類計(jì)數(shù)，結(jié)果是少突膠質(zhì)細(xì)胞：星形膠質(zhì)細(xì)胞為2∶1的比例。也有研究發(fā)現(xiàn)，隨著視神經(jīng)的發(fā)育成熟，神經(jīng)纖維會逐漸減少，髓鞘形成細(xì)胞逐漸增多［10］。筆者認(rèn)為，這與其計(jì)數(shù)及鑒定方法有關(guān)。由于電鏡的放大倍數(shù)較大及少突膠質(zhì)細(xì)胞多形性，因此，很難對細(xì)胞進(jìn)行比較精確地計(jì)數(shù)。本實(shí)驗(yàn)采用少突膠質(zhì)細(xì)胞及星形膠質(zhì)細(xì)胞特異性標(biāo)記物對細(xì)胞進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色并在光鏡下觀測，極大地避免了分類上的誤差；另外，考慮到在視神經(jīng)的發(fā)育過程中，隨著視神經(jīng)髓鞘的形成，其直徑也要增粗，因此，在統(tǒng)計(jì)相同面積內(nèi)的細(xì)胞數(shù)時(shí)，用視神經(jīng)的直徑對這些數(shù)字進(jìn)行修正，從而更真實(shí)地反映了發(fā)育大鼠視神經(jīng)中各細(xì)胞成份的變化規(guī)律。

4 結(jié)論

本研究從組織形態(tài)學(xué)上初步闡明了發(fā)育大鼠視神經(jīng)的變化規(guī)律，即視神經(jīng)發(fā)育成熟的過程是由少突膠質(zhì)細(xì)胞逐漸形成髓鞘的過程，這一結(jié)果可為有關(guān)視神經(jīng)的研究提供實(shí)驗(yàn)資料。

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