馮素萍，梁賈春子，李永樁，徐貞楨，武耀廷

(瓊州學(xué)院熱帶生物與農(nóng)學(xué)院，三亞市熱帶植物分子育種實(shí)驗(yàn)室，海南三亞 572200)

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巴西橡膠樹抗病性相關(guān)基因研究進(jìn)展

馮素萍，梁賈春子，李永樁，徐貞楨，武耀廷*

(瓊州學(xué)院熱帶生物與農(nóng)學(xué)院，三亞市熱帶植物分子育種實(shí)驗(yàn)室，海南三亞 572200)

摘要著重介紹Mlo基因、含錳的超氧化物歧化酶(MnSOD)基因、橡膠凝集因子基因、死皮病相關(guān)基因、幾丁質(zhì)酶基因等巴西橡膠樹抗病性相關(guān)基因的研究進(jìn)展，并對(duì)研究中存在的問(wèn)題及不足提出解決辦法，對(duì)進(jìn)一步的研究進(jìn)行展望。

關(guān)鍵詞巴西橡膠樹；分子生物學(xué)；抗病基因；基因工程

Research Progress of Resistance Related Genes onHeveabrasiliensis

FENG Su-ping, LIANG Jia-chun-zi, LI Yong-zhuang, WU Yao-ting*et al(Key Laboratory of Tropical Crop Molecular Breeding of Sanya, College of Tropic Biology and Agronomy, Qiongzhou University, Sanya, Hainan, 572200)

AbstractThis paper will focus on research progress of resistance related genes onHeveabrasiliensis, such as, the MLO gene, manganese superoxide dismutase (MnSOD) gene, latex agglutination factor gene, tapping panel dryness related gene and chitinase gene, problems and deficiencies on these studies, also the prospects for further research.

Key wordsHeveabrasiliensis; Molecular biology; Resistance gene; Gene engineering

橡膠與石油、鋼鐵、煤炭作為四大工業(yè)原料，是一種重要的戰(zhàn)略資源。天然橡膠具有彈性好、絕緣性強(qiáng)、可塑性高以及防水隔氣、抗拉耐磨等優(yōu)點(diǎn)，已被廣泛用于航空航天、汽車制造以及日常生活的各個(gè)方面[1]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，來(lái)自7個(gè)科300多個(gè)屬2 000多種植物可以合成天然橡膠，但從橡膠的產(chǎn)量、質(zhì)量、采膠與提取的難易程度以及經(jīng)濟(jì)效益上考量，僅有巴西橡膠可以作為一種具有商業(yè)開發(fā)價(jià)值的經(jīng)濟(jì)作物。目前巴西橡膠樹已在世界范圍內(nèi)大規(guī)模種植，成為天然橡膠的唯一來(lái)源[2]。我國(guó)是天然橡膠消費(fèi)大國(guó)，據(jù)統(tǒng)計(jì)，2010年我國(guó)天然橡膠使用375.3萬(wàn)t，而產(chǎn)量?jī)H為68.8萬(wàn)t[3]。如何提高我國(guó)的橡膠產(chǎn)量成為亟待解決的問(wèn)題。但近年來(lái)多種橡膠樹病害的暴發(fā)嚴(yán)重影響天然橡膠的產(chǎn)量，據(jù)統(tǒng)計(jì)，約1/4的橡膠損傷來(lái)自于橡膠樹的病害問(wèn)題。目前影響最為嚴(yán)重的是白粉病、炭疽病、死皮病以及根病。

目前，對(duì)于巴西橡膠樹病害主要使用化學(xué)防治，通過(guò)化學(xué)藥劑抑制病原菌。但諸多問(wèn)題的存在使化學(xué)防治并不理想，如化學(xué)藥劑造成環(huán)境的污染以及病原菌抗藥性的產(chǎn)生，而防治橡膠樹炭疽病的化學(xué)藥劑種類貧乏且價(jià)格昂貴，并不適合大規(guī)模推廣。隨著科技的進(jìn)步，對(duì)于巴西橡膠樹的研究從形態(tài)學(xué)、生理學(xué)、栽培學(xué)向著更加深入的分子生物學(xué)水平發(fā)展。對(duì)橡膠樹病害的防治也從化學(xué)藥劑向著抗病基因工程的方向發(fā)展。據(jù)報(bào)道，橡膠樹抗病基因工程的推廣可以將橡膠產(chǎn)量整體提高10%~20%[4]。筆者就巴西橡膠樹抗病性相關(guān)基因的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1Mlo基因

Mlo基因是植物重要的抗病基因，該基因的隱性突變可使植物獲得廣譜持久的抗病性[5]。Mlo基因在大麥、小麥、水稻、擬南芥、煙草中被發(fā)現(xiàn)，其廣譜持久的抗病性也在一些植物中被驗(yàn)證。覃碧等[6]運(yùn)用同源搜索手段，將葡萄Mlo9基因作為探針，對(duì)巴西橡膠樹的EST數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行搜索，拼接搜索結(jié)果，獲得Mlo9基因的cDNA序列。再通過(guò)RT-PCR獲得Mlo9基因，為其命名為HbMlo9。通過(guò)軟件分析蛋白結(jié)構(gòu)域發(fā)現(xiàn)，其相對(duì)保守，包含9次跨膜結(jié)構(gòu)和1個(gè)N端信號(hào)肽。并且HbMlo9與蓖麻Mlo相似性高達(dá)88%，與桃Mlo相似性達(dá)到79%。此研究為驗(yàn)證Mlo9基因在巴西橡膠樹抗病中的功能奠定基礎(chǔ)。

2含錳的超氧化物歧化酶(MnSOD)基因

超氧化物歧化酶(SOD)作為巴西橡膠樹體內(nèi)重要的酶，擔(dān)任著活性氧的清除以及保護(hù)黃色體膜免受氧自由基侵襲的任務(wù)。研究發(fā)現(xiàn)，超氧化物歧化酶的降低會(huì)造成橡膠樹乳管細(xì)胞早衰以及生理紊亂等病害，其與死皮病的發(fā)生有著密切的關(guān)系[7]。Miao等[8]將煙草含錳的超氧化物歧化酶基因作為探針，搜索出巴西橡膠樹的MnSOD基因，通過(guò)RT-PCR技術(shù)反轉(zhuǎn)錄出巴西橡膠樹MnSOD基因的全長(zhǎng)cDNA。在之后的研究中進(jìn)一步驗(yàn)證了橡膠樹MnSOD基因?yàn)橐粋€(gè)多基因家族。

3橡膠凝集因子基因

橡膠凝集因子可以與幾丁質(zhì)結(jié)合，分子量為4.7kD，為單鏈結(jié)構(gòu)。其存在于巴西橡膠樹乳管細(xì)胞特化的液泡內(nèi)。橡膠凝集因子對(duì)于真菌的侵襲具有一定的抗性，在橡膠粒子的凝絮和乳膠的凝固工程中具有重要作用。Deng等[9]通過(guò)RT-PCR技術(shù)反轉(zhuǎn)錄出一段橡膠凝集因子基因，并將啟動(dòng)子通過(guò)染色體步移法獲得。

4死皮病相關(guān)基因

橡膠樹有2種死皮病，一種為褐皮病，由于其發(fā)生率不高且造成經(jīng)濟(jì)損失不大并不作為研究的重點(diǎn)。另一種死皮病為割面干枯病，對(duì)于各地巴西橡膠樹種植都造成嚴(yán)重危害，是一種復(fù)雜的生理綜合癥，研究也較為廣泛。黃貴修等[10]通過(guò)簡(jiǎn)并PCR法將4種在死皮病橡膠樹中未出現(xiàn)的DNA片段擴(kuò)增出來(lái)，以Hb1、Hb2、Hb3、Hb4命名。并發(fā)現(xiàn)

Hb1在死皮病橡膠樹中的表達(dá)受到較強(qiáng)抑制。Chen等[11]將Hb1全長(zhǎng)基因進(jìn)行克隆，并將其命名為HbMyb1。張?jiān)葡糩12]將與HbMyb1啟動(dòng)子序列結(jié)合的Hb2基因通過(guò)酵母單雜交技術(shù)克隆出來(lái)，并證明Hb2基因在不同品系的膠乳中差異不大，但在死皮病橡膠樹中表達(dá)水平較低。

5幾丁質(zhì)酶基因

幾丁質(zhì)酶作為重要的抗病酶，其在橡膠樹受到病原菌侵襲時(shí)可以有效地裂解病原菌細(xì)胞壁的幾丁質(zhì)，保護(hù)橡膠樹不受侵染。其在正常時(shí)表達(dá)不高，但有病原菌侵染時(shí)，其表達(dá)水平會(huì)顯著增高[13]。黃瑾等[14]從橡膠樹中克隆得到935bp的幾丁質(zhì)酶基因，并發(fā)現(xiàn)幾丁質(zhì)酶基因在不同橡膠樹品系中表達(dá)水平存在差異。

6其他

除上述的抗病性相關(guān)基因，程漢等[15]還克隆出抗寒相關(guān)基因CBF1的全長(zhǎng)序列；羅安定等[16]發(fā)現(xiàn)了一條與抗白粉病連鎖的AFLP標(biāo)記；游啟孫等[2]對(duì)巴西橡膠NBS-LRR抗病基因類似物多樣性進(jìn)行了分析；β-1，3-葡聚糖酶基因也被研究人員克隆出來(lái)。這些抗病性相關(guān)基因研究的不斷深入，為科研工作者進(jìn)一步認(rèn)識(shí)巴西橡膠樹的抗病機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

7總結(jié)與展望

綜上所述，研究者對(duì)于巴西橡膠樹抗病相關(guān)基因的研究取得了階段性的成果，對(duì)于Mlo基因、含錳的超氧化物歧化酶基因、橡膠凝集因子基因、死皮病相關(guān)基因、幾丁質(zhì)酶基因的了解也逐漸深入。但相較于糧食或模式植物而言，橡膠樹在分子水平的研究起步較晚，研究基礎(chǔ)不足，研究時(shí)間較為滯后。雖然研究者不斷探索巴西橡膠樹抗病相關(guān)基因的克隆方法及其生物學(xué)功能，但使用方法較為單一，最為常用的手段是使用異源同類基因作為探針，從巴西橡膠樹cDNA文庫(kù)中釣取相關(guān)抗病基因，而直接克隆出新的抗病相關(guān)基因的情況較少。而這種依賴于異源同類基因的研究方法很難從整體水平上把握巴西橡膠樹的致病機(jī)制和抗病機(jī)制。為了克服此弊端，研究者應(yīng)該更加深入研究抗病相關(guān)基因與病害發(fā)生的分子機(jī)制，完善橡膠樹的遺傳轉(zhuǎn)化體系，構(gòu)建橡膠樹的遺傳圖譜。運(yùn)用基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)以及蛋白質(zhì)組學(xué)的研究方法，從基因、RNA以及蛋白質(zhì)的整體水平研究巴西橡膠樹的疾病發(fā)生機(jī)制以及抗病相關(guān)機(jī)制，為橡膠樹病害的防治提供理論基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)

[1] 史敏晶，程成，田維敏.低溫促進(jìn)巴西橡膠樹排膠的生理基礎(chǔ)[J].熱帶作物學(xué)報(bào)，2015，36(1)：92-96.

[2] 游啟孫，莫廷輝，曾麗星，等.巴西橡膠NBS-LRR抗病基因類似物多樣性分析[J].南方農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2013，44(3)：371-376

[3] 徐文英.中國(guó)天然橡膠生產(chǎn)現(xiàn)狀及進(jìn)口情況分析[J].中國(guó)橡膠，2010(11)：4-7.

[4] 鄒智，楊禮富，王真輝.巴西橡膠樹轉(zhuǎn)基因研究現(xiàn)狀與展望[J].中國(guó)生物工程雜志，2010(1)：85-92.

[5] LIU Q，ZHU H.Molecular evolution of the MLO gene family inOryzasativaand their functional divergence[J].Gene，2008，409(1/2)：1-10.

[6] 覃碧，王萌，林雨見(jiàn)，等.巴西橡膠樹 HbMlo9 基因克隆及其序列特征分析[J].熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，33(8)：47-52.

[7] 許聞獻(xiàn)，?，F(xiàn)周.橡膠死皮過(guò)氧化物酶同工酶和超氧化物歧化酶同工酶的研究[J].熱帶作物學(xué)報(bào)，1988，9(1)：31-36.

[8] MIAO Z H，JOHN J G.Molecularcloning，characterization and expression of Mn superoxide dismutase from the rubber tree(Hevea brasiliensis)[J].Plant Molecular Biology，1993，23：267-277.

[9] DENG X D，F(xiàn)EI X W，HUANG J S.Isolation and analysis of rubber hevein gene and its promoter sequence [J].Acta botanica sinica，2002，44(8)：936-940.

[10] 黃貴修，吳坤鑫，陳守才.利用mRNA差別顯示技術(shù)分離橡膠樹死皮病相關(guān)cDNA.熱帶作物學(xué)報(bào)，2002，23(3)：36-42.

[11] CHEN S C，PENG S Q，HUANG G X，et al.Association of decreased expression of a Mby-related transcription factor with the TDP(tapping panel dryness)disease in rubber treeHeveabrasiliensis[J].Plant molecular biology，2003，51(1)：51-58.

[12] 張?jiān)葡?巴西橡膠樹HbMybl調(diào)控基因的克隆及表達(dá)[D].儋州：華南熱帶農(nóng)業(yè)大學(xué)，2005.

[13] 陳三鳳.幾丁質(zhì)酶研究歷史和發(fā)展前景[J].微生物通報(bào)，1993，20(6)：156-160.

[14] 黃瑾，?，F(xiàn)周，金志強(qiáng).橡膠樹膠乳幾丁質(zhì)酶基因表達(dá)的品種差異[J].熱帶作物學(xué)報(bào)，2004，25 (1)：2-4.

[15] 程漢，安澤偉，黃華孫.巴西橡膠樹CBF1基因的克隆和序列分析[J].熱帶作物學(xué)報(bào)，2005，26 (3)：50-55.

[16] 羅安定，陳守才，吳坤鑫，等.AFLP在橡膠樹優(yōu)異種質(zhì)研究中的應(yīng)用[J].植物學(xué)，2001，43(9)：941-947.

收稿日期2015-10-28

作者簡(jiǎn)介馮素萍(1972- )，女，河南汝州人，副教授，博士，從事植物分子育種研究。*通訊作者。

基金項(xiàng)目國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31100495)；海南省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(314084)。

中圖分類號(hào)S 794.1

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A

文章編號(hào)0517-6611(2015)33-191-01