檀巧婷，嚴 佳，鐘桂香，宋洪濤（南京軍區(qū)福州總醫(yī)院藥學科，福建福州350025）

硝酸甘油軟膏的無菌檢查方法學驗證

檀巧婷，嚴 佳，鐘桂香，宋洪濤（南京軍區(qū)福州總醫(yī)院藥學科，福建福州350025）

目的建立硝酸甘油軟膏的無菌檢查方法，并對方法進行驗證。方法取預熱至45℃的供試品10支（15 g／支），每支稱取1 g，加至含溶化的司盤80、聚山梨酯80無菌混合物和無菌玻璃珠的錐形瓶中，振搖混勻后，加入45℃的pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨水緩沖液至100 m l，使供試品充分乳化。按薄膜過濾法，細菌、真菌每膜用300 m l pH 7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液沖洗，消除抑菌活性。結果經(jīng)方法驗證，硝酸甘油軟膏供試品組、陰性對照組均無菌生長，試驗組各濾器中試驗菌與相應對照組比較均生長良好，說明供試品在該檢驗量和檢驗條件下無抑菌作用或其抑菌作用可以忽略不計。結論薄膜過濾法有效可行，可用于硝酸甘油軟膏的無菌檢查。

硝酸甘油軟膏；無菌檢查；方法學驗證

硝酸甘油軟膏主要成分為硝酸甘油，能直接松弛平滑肌，對膽堿能及腎上腺素能神經(jīng)支配的平滑肌均有作用，以松弛血管平滑肌作用最強，尤其是小血管平滑肌。據(jù)文獻報道［1-4］，硝酸甘油軟膏對于治療肛裂、痔瘡等具有較好的療效。我科自制的硝酸甘油軟膏，主要用于治療肛裂及緩解與肛裂有關的癥狀，也可用于痔瘡治療，是一種血管擴張類藥物，按照《中國藥典》2010年版附錄規(guī)定，用于燒傷或嚴重創(chuàng)傷的軟膏劑應進行無菌檢查，并對方法進行驗證，以保證該方法的可靠性。因此，筆者按規(guī)定對硝酸甘油軟膏無菌檢查方法進行研究，并進行驗證。

1 儀器與材料

1.1儀器 GHP-9160型隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海一恒科技有限公司）、DHG-9145A型電熱恒溫鼓風干燥箱（上海一恒科技有限公司）、SW-CJ-1B型凈化工作臺（蘇州凈化設備廠）、M JPS-150型霉菌培養(yǎng)箱（上海精宏實驗設備有限公司）、WJ-6無菌檢測儀（天津市羅根科技有限公司）、LDZX-40KBS型立式壓力蒸汽滅菌器（上海申安醫(yī)療器械廠）。

1.2試驗菌種 試驗用菌分別是：金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）［CMCC（B）26003］（第3代）；生孢梭菌（Clostridium sporogenes）［CMCC（B）64941］（第4代）；枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）［CMCC（B）63501］（第3代）；白念珠菌（Candida albicans）［CMCC（F）98001］（第4代）；黑曲霉（Aspergillusniger）［CMCC（F）98003］（第3代）；銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）［CMCC（F）10104］（第3代），均由福建省食品藥品檢驗所提供。

1.3培養(yǎng)基及稀釋液 本次試驗所用到的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基（批號120417）、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（批號121224）、玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基（批號130221）、改良馬丁培養(yǎng)基（批號1211282）、膽鹽乳糖培養(yǎng)基（批號1204192）、甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基（批號111201）、溴化十六烷基三甲胺瓊脂培養(yǎng)基（批號131124）和pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液（批號1212132）均由北京三藥科技開發(fā)公司提供。

1.4樣品 硝酸甘油軟膏（規(guī)格15 g：30 mg），由南京軍區(qū)福州總醫(yī)院藥學科制劑室提供。

2 方法與結果

2.1菌液制備

2.1.1 接種金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌的新鮮培養(yǎng)物至營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，接種生孢梭菌的新鮮培養(yǎng)物至硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基中，經(jīng)30～35℃培養(yǎng)18～24 h后，分別取上述培養(yǎng)物1 m l＋9 m l 0.9%無菌氯化鈉溶液，10倍稀釋至10－6～10－7，細菌數(shù)為50～100 CFU／m l，做活菌計數(shù)備用。

2.1.2 接種白念珠菌的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁培養(yǎng)基中，經(jīng)23～28℃培養(yǎng)24～48 h后，取白念珠菌液體培養(yǎng)物1 m l＋9 m l 0.9%無菌氯化鈉溶液，10倍稀釋至10－4～10－7，細菌數(shù)為50～100 CFU／m l，做活菌計數(shù)備用。

2.1.3 接種黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁瓊脂斜面培養(yǎng)基中，經(jīng)23～28℃培養(yǎng)5～7 d后，取黑曲霉斜面培養(yǎng)物，加3～5 m l 0.9%無菌氯化鈉溶液將孢子洗脫，吸出孢子懸液1 m l＋9 m l 0.9%無菌氯化鈉溶液，10倍稀釋至10－4～10－7，細菌數(shù)為50～100 CFU／m l，做活菌計數(shù)備用。

2.2供試液制備 取預熱至45℃的供試品10支，每支稱取1 g，加至含溶化的（溫度不超過45℃）5 g司盤80、10 g聚山梨酯80無菌混合物和無菌玻璃珠的錐形瓶中，劇烈振搖，混勻后，慢慢加入45℃的pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨水緩沖液至100 m l，邊加邊振搖，使供試品充分乳化。

2.3供試液取樣量 每株驗證菌檢驗量為10支。

2.4方法驗證實驗（薄膜過濾法） 金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、生孢梭菌、白念珠菌、黑曲霉菌：取制備好的供試液注入濾筒中，按薄膜過濾法過濾，用pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液約300m l沖洗，每次100m l，分次振搖沖洗，在最后一次沖洗液中加入小于100 CFU的試驗菌，過濾，將培養(yǎng)基100 m l加至濾筒中；另一個濾筒加入同體積培養(yǎng)基及等量的試驗菌，作為陽性對照，并做陰性對照，按規(guī)定溫度培養(yǎng)3～5 d，逐日觀察。各試驗菌同法操作。實驗結果見表1。

表1 無菌檢查驗證試驗結果

3 討論

3.1在檢驗量為10支，每支取1 g，每片膜沖洗量為100m l×3次的條件下，樣品對金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、生孢梭菌、白念珠菌、黑曲霉無抑菌作用。

3.2硝酸甘油軟膏在含供試品各管中的試驗菌均生長良好，并且與陽性對照試管內的培養(yǎng)結果相似，則供試品的檢驗量在該條件下無抑菌活性或抑菌活性消除，可采用薄膜過濾法進行無菌檢查。

3.3硝酸甘油軟膏為淡黃色半固體狀外用制劑，是以凡士林為油脂性基質，因此本文采用稀釋劑稀釋、保溫至45℃振搖混勻，并加入司盤80、聚山梨酯80，增加供試品分散性，使供試品充分乳化均勻，避免油性基質等細小顆粒在薄膜過濾過程中堵塞濾膜［5］。

［1］ 山院飛，馮六泉，張曉元，等.硝酸甘油軟膏聯(lián)合創(chuàng)灼膏治療肛裂療效觀察［J］.人民軍醫(yī)，2011，54（3）：209-210.

［2］ 徐 毅.硝酸甘油軟膏加擴肛與單純擴肛治療96例對照觀察［J］.結直腸肛門外科，2012，18（3）：182-183.

［3］ 張 倩，林銀花，王 娟，等.硝酸甘油軟膏的制備與質量控制［J］.醫(yī)藥導報，2010，29（6）：768-770.

［4］ 孔 嬋.復方硝酸甘油軟膏和九華膏治療早期肛裂的療效對比［J］.西部醫(yī)學，2009，21（9）：1540-1541.

［5］ 吳 鑫，陳 希，鄢雷娜.鹽酸特比萘芬乳膏微生物限度檢查法的方法學研究［J］.中國藥事，2013，27（1）：48-64.

Validation for sterility testmethod of nitroglycerin ointment

TAN Qiaoting，YAN Jia，ZHONG Guixiang，SONG Hongtao（Department of Pharmacy，F(xiàn)uzhou General Hospital of Nanjing M illitary Region，F(xiàn)uzhou 350025，China）

ObjectiveTo establish and validate a method of sterility test for nitroglycerin ointment and validate this method.MethodsTen nitroglycerin ointments of 1 g were preheated oven to 45℃for sample，and added to conical flask which containingmelted span 80，polysorbate80 sterilemixture and sterile glass beads，and were shakeaftermixing，the sample fully emulsified by adding to 100 m l 45℃pH 7.0 sterile sodium chloride-peptone water buffer.According to themethod ofmembrane filtration，bacteria and fungus in eachmembranew ith 300m l pH 7.0 sterile sodium chloride-peptonewater buffer flush，the bacteriostatic activity was elim inated.ResultsBy the method validation，nitroglycerin ointment sample group，negative control group were sterile grow th，and test group in each filter of the test bacteria compared w ith control groupswere grow ing well，so the samples had no inhibitory effector the antimicrobialeffectwould not take into account.ConclusionMembrane filtration was reliable，which could be used for sterility test for nitroglycerin ointment.

nitroglycerin ointment；sterility test；validation of themethod

R943

］ A

1006-0111（2015）03-0253-02

10.3969／j.issn.1006－0111.2015.03.016

2014-04-23

2014-09-24

［本文編輯］ 顧文華

檀巧婷，藥師.研究方向：藥物分析.Tel：（0591）22859963；E-mail：tqt-010＠163.com

宋洪濤，博士，主任藥師，博士生導師.Tel：（0591）22859459；E-mail：sohoto＠vip.163.com