韓雪嬌，王 亮，楊紅申，侯宏偉，李亞妹，李香蘭

（1.河北省邢臺(tái)市第三醫(yī)院呼吸科，河北 邢臺(tái)054099；2.河北省胸科醫(yī)院呼吸科，河北 石家莊050041；3.河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院呼吸科，河北 石家莊050000；4.河北省胸科醫(yī)院感染科，河北 石家莊050041；5.河北省胸科醫(yī)院護(hù)理部，河北 石家莊050041；6.河北省胸科醫(yī)院急診科，河北 石家莊050041）

支氣管哮喘是一種慢性呼吸道炎癥性疾病，主要特征是氣道炎癥、氣道高反應(yīng)性和氣道重塑。其中上皮細(xì)胞的脫落、基底膜的增厚、膠原的沉積、血管的擴(kuò)張和增殖、氣道平滑肌細(xì)胞的增殖、黏液腺和杯狀細(xì)胞的增生等，稱為氣道重塑［1］。而氣道重塑是難治性哮喘的主要原因。在哮喘的血管生成和重塑中，有多種細(xì)胞及細(xì)胞因子等參與這一過(guò)程，而血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）和基質(zhì)金屬蛋白酶9（matrix metalloproteinases-9，MMP-9）是其中2個(gè)重要因子。近來(lái)研究表明，多西環(huán)素可抑制VEGF誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的增殖，并可降低VEGF誘導(dǎo)的角膜新生血管形成的長(zhǎng)度與面積；多西環(huán)素具有強(qiáng)大的抑制MMP-9作用。本研究在成功建立了大鼠哮喘模型的基礎(chǔ)上，采用多西環(huán)素作為干預(yù)措施，通過(guò)檢測(cè)VEGF、MMP-9的變化及肺組織內(nèi)血管密度等的變化，探討多西環(huán)素抑制氣道重塑的可能機(jī)制，旨在為難治性哮喘提供新的治療方法。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)SD大鼠33只（雄性，6周齡，體質(zhì)量50～100g，購(gòu)于河北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心），

給予自由飲食（標(biāo)準(zhǔn)日糧和無(wú)菌飲用水，飼料購(gòu)于河北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心）清潔級(jí)飼養(yǎng)，3d后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)；實(shí)驗(yàn)場(chǎng)所在河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室和呼吸內(nèi)科實(shí)驗(yàn)室。

1.2 儀器設(shè)備和試劑 高速冷凍離心機(jī)（1-15K，美國(guó)Sigma），酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀（MK3，芬蘭雷勃），石蠟切片機(jī)（LEICA RM2125，萊卡上海分公司），Motic 6.0數(shù)碼醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)（廈門麥克奧迪儀器儀表有限公司）。氫氧化鋁（美國(guó)sigma），氫氧化鋁（天津永大化學(xué)試劑開(kāi)發(fā)中心），鹽酸多西環(huán)素片（江蘇瑞年前進(jìn)制藥有限公司），VEGF ELISA試劑盒（上海森熊科技實(shí)業(yè)有限公司），MMP-9兔抗IgG多克隆抗體（武漢博士德生物技術(shù)有限公司），DAB顯色劑及SP9001試劑盒（北京中山生物技術(shù)有限公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法 將33只清潔級(jí)SD大鼠隨機(jī)分成對(duì)照組、哮喘組和多西環(huán)素組各11只。其中哮喘組和多西環(huán)環(huán)素組分別于實(shí)驗(yàn)第1、8天向大鼠腹腔注射卵蛋白100mg和氫氧化鋁100mg（混于生理鹽水2mL中）進(jìn)行致敏，第15天起將大鼠置于自制的非完全密閉霧化吸入箱內(nèi)，給予卵蛋白溶液5mL霧化吸入，隔日1次，每次30min，共激發(fā)20次，根據(jù)激發(fā)效果調(diào)整給藥濃度，1～4次為1%，5～8次為1.5%，9～12次為2%，13～16次為2.5%，17～20次為3%。當(dāng)大鼠出現(xiàn)煩躁、嗆咳、呼吸急促、活動(dòng)量下降等典型的哮喘發(fā)作的表現(xiàn)時(shí)為激發(fā)成功。而多西環(huán)素組則在每次卵蛋白霧化吸入前30min按30mg／kg經(jīng)口腔灌服方式給予多西環(huán)素［2］，對(duì)照組以生理鹽水代替卵蛋白；以上2組致敏和激發(fā)方法與哮喘組相同。在最后一次激發(fā)24h后，將大鼠以1%戊巴比妥鈉麻醉，沿胸腔正中線打開(kāi)胸腔，游離后暴露肺組織，結(jié)扎右主支氣管后，取右肺下葉以4%甲醛溶液浸泡固定，待行病理及免疫組織化學(xué)；左肺行肺泡灌洗，回收肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BLAF），以1 000r／min離心10min，取其沉淀進(jìn)行細(xì)胞分類和計(jì)數(shù)。

1.4 BLAF細(xì)胞計(jì)數(shù)和分類 BLAF離心后，在其細(xì)胞沉渣中加入200μL 0.9%生理鹽水，混勻后取20μL混懸液，在其中加入380μL冰醋酸；之后吸出20μL混懸液在顯微鏡下用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)細(xì)胞總數(shù)。細(xì)胞沉淀甩片2張，染色（采用瑞氏-吉姆薩法染色）后行細(xì)胞分類計(jì)數(shù)，每個(gè)標(biāo)本在高倍顯微鏡下計(jì)數(shù)至少400個(gè)有核細(xì)胞（除紅細(xì)胞和上皮細(xì)胞外）總數(shù)，分別計(jì)數(shù)其中的中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞，從而獲得各類細(xì)胞的百分比，并由此計(jì)算出其絕對(duì)值。以上細(xì)胞計(jì)數(shù)均采用單盲法。

1.5 病理分析 ①HE染色：打開(kāi)大鼠胸腔，取右肺下葉，并將所取右肺下葉浸泡于4%甲醛溶液中固定，石蠟包埋，切取5μm厚的截面標(biāo)本，行常規(guī)HE染色，用中性樹(shù)膠封片，在光鏡下觀察病理改變。②免疫組織化學(xué)法檢測(cè)肺組織MMP-9及VEGF的表達(dá)：將石蠟切片脫蠟水化，反復(fù)以磷酸緩沖鹽溶液清洗，以過(guò)氧化氫室溫下孵育，再以山羊血清溫箱濕盒內(nèi)孵育，再次依次給予一抗、二抗后孵育，顯色，經(jīng)梯度酒精逐級(jí)脫水，最后以中性樹(shù)膠封固。陰性對(duì)照以磷酸緩沖鹽溶液替代一抗，余步驟同上。肺組織MMP-9及VEGF的表達(dá)以平均光密度值來(lái)表示。

1.6 圖像分析 于光學(xué)顯微鏡下找到完整支氣管，切片，在光學(xué)顯微鏡下（放大100倍）隨機(jī)選取完整的支氣管橫切面（中氣道，內(nèi)周徑1 500～2 000 μm），使用病理圖像采集系統(tǒng)采集圖片。然后采用真彩色醫(yī)學(xué)圖像分析軟件進(jìn)行測(cè)量分析，測(cè)量完整的無(wú)軟骨支氣管橫斷面的支氣管壁內(nèi)周長(zhǎng)（perimeter bronchial basement membrane，Pbm）、管壁面積（airway wall area，WAt）及血管密度，并計(jì)算標(biāo)化測(cè)量值（WAt／Pbm）表示氣道壁厚度。

1.7 ELISA法測(cè)定血清中VEGF含量 建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。待測(cè)品孔中每孔各加入待測(cè)樣品100μL，將反應(yīng)板置于37℃120min。用洗滌液將反應(yīng)板充分洗滌4～6次，每孔中加入第一抗體工作液50μL，將反應(yīng)板充分混勻后置于37℃60min。用洗滌液將反應(yīng)板充分洗滌4～6次。每孔加酶標(biāo)抗體工作液100μL，將反應(yīng)板置于37℃60min。用洗滌液將反應(yīng)板充分洗滌4～6次，向?yàn)V紙上印干每孔加入底物液100μL，置于37℃暗處反應(yīng)5～10min。每孔加入50μL終止液混勻。在450nm處測(cè)吸光值。以標(biāo)準(zhǔn)品3 200、1 600、800、400、200、100、50、0ng／L之吸光值在半對(duì)數(shù)紙上作圖，畫出標(biāo)準(zhǔn)曲線，將濃度作為X軸（對(duì)數(shù)軸），吸光值作為Y軸（線性軸）。曲線應(yīng)為一光滑曲線，根據(jù)樣品吸光值OD值在該曲線圖上查出相應(yīng)大鼠VEGF含量。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 動(dòng)物行為 哮喘組與多西環(huán)素組大鼠在激發(fā)過(guò)程中均出現(xiàn)呼吸急促、口唇發(fā)紺、煩躁不安等表現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中出現(xiàn)毛色晦暗、反應(yīng)遲鈍、精神萎靡、體質(zhì)量較正常組下降等情況。而對(duì)照組大鼠在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中均未出現(xiàn)呼吸、精神、行為、飲食等方面的明顯變化。

2.2 各組細(xì)胞數(shù)比較 哮喘組BALF中的細(xì)胞總數(shù)、中性粒細(xì)胞數(shù)、淋巴細(xì)胞數(shù)、嗜酸性細(xì)胞數(shù)明顯高于對(duì)照組（P＜0.01）；多西環(huán)素組細(xì)胞總數(shù)、中性粒細(xì)胞數(shù)、淋巴細(xì)胞數(shù)、嗜酸性細(xì)胞數(shù)明顯少于哮喘組（P＜0.01），但仍多于對(duì)照組（P＜0.01）。見(jiàn)表1。

表1 3組BALF中細(xì)胞總數(shù)、中性粒細(xì)胞數(shù)、淋巴細(xì)胞數(shù)及嗜酸性粒細(xì)胞比較Table 1 The numbers of total cells，neutrophils，lymphocytes and eosinophils in BALF among three groups（n=11,±s，×106／L）

表1 3組BALF中細(xì)胞總數(shù)、中性粒細(xì)胞數(shù)、淋巴細(xì)胞數(shù)及嗜酸性粒細(xì)胞比較Table 1 The numbers of total cells，neutrophils，lymphocytes and eosinophils in BALF among three groups（n=11,±s，×106／L）

＊P＜0.01與對(duì)照組比較 ＃P＜0.01與哮喘組比較（SNK-q檢驗(yàn)）

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2.3 肺組織切片HE染色 對(duì)照組大鼠肺組織病理切片可見(jiàn)支氣管黏膜上皮、黏膜肌層、肺組織結(jié)構(gòu)完整，支氣管管腔規(guī)則，偶可見(jiàn)炎性細(xì)胞（圖1A）。哮喘組大鼠肺組織病理切片可見(jiàn)支氣管黏膜增厚，氣道平滑肌明顯增厚、血管增生、血管壁增厚，支氣管黏膜下、肺泡間質(zhì)可見(jiàn)大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)（圖1B）。多西環(huán)素組支氣管壁增厚程度、血管增生及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)等均較哮喘組減輕（圖1C）。

2.4 各組MMP-9、VEGF的表達(dá) 哮喘組肺組織中MMP-9的表達(dá)明顯多于對(duì)照組（P＜0.01）；多西環(huán)素組較哮喘組有明顯降低（P＜0.01），但仍高于對(duì)照組（P＜0.01）。哮喘組肺組織中和血清中的VEGF表達(dá)水平均明顯高于對(duì)照組（P＜0.01）；而多西環(huán)素組則明顯低于哮喘組（P＜0.01），但仍高于對(duì)照組（P＜0.01）。見(jiàn)表2，圖2A～C。

2.5 各組 Wat／Pbm及血管密度比較 哮喘組WAt／Pbm和血管密度均高于對(duì)照組（P＜0.01）；多西環(huán)素組 WAt／Pbm和血管密度明顯低于哮喘組（P＜0.01），但仍高于對(duì)照組（P＜0.01）。見(jiàn)表3，圖3A～C。

表2 3組MMP-9、VEGF表達(dá)比較Table 2 MMP-9and VEGF expression in lung tissues among three groups（n=11，±s）

表2 3組MMP-9、VEGF表達(dá)比較Table 2 MMP-9and VEGF expression in lung tissues among three groups（n=11，±s）

＊P＜0.01與對(duì)照組比較 ＃P＜0.01與哮喘組比較（SNK-q檢驗(yàn)）

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表3 3組WAt／Pbm及血管密度比較Table 3 The airway wall thickness and vasculardensity among three groups（n=11±s）

表3 3組WAt／Pbm及血管密度比較Table 3 The airway wall thickness and vasculardensity among three groups（n=11±s）

＊P＜0.01與對(duì)照組比較 ＃P＜0.01與哮喘組比較（SNK-q檢驗(yàn)）

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圖1 3組肺組織的HE染色（HE×100）A.對(duì)照組；B.哮喘組；C.多西環(huán)素組Figure 1 HE staining of lung tissue among three groups（HE×100）

圖2 3組肺組織中VEGF的表達(dá)（免疫組織化學(xué) ×100）A.對(duì)照組；B.哮喘組；C.多西環(huán)素組Figure 2 The expression level of VEGF in lung tissue of three groups（SP×100）

圖3 3組肺組織中MMP-9的表達(dá)（免疫組織化學(xué) ×100）A.對(duì)照組；B.哮喘組；C.多西環(huán)素組Figure 3 MMP-9expression in lung tissue of three groups（SP×100）

3 討 論

3.1 哮喘患者VEGF、MMP-9表達(dá)水平的變化目前研究認(rèn)為，氣道炎癥、氣道高反應(yīng)性和氣道重塑是支氣管哮喘的主要病理生理特征，其中氣道重塑則是導(dǎo)致難治性哮喘的主要原因。而血管重塑是氣道重塑的前提和重要組成部分。多種細(xì)胞因子、炎性介質(zhì)等參與了哮喘氣道重塑過(guò)程。而VEGF和MMP-9則是其中2種參與氣道重塑、血管重塑的重要因子［3-5］。近年來(lái)世界范圍內(nèi)哮喘患病率明顯升高，在不同國(guó)家或同一國(guó)家不同地區(qū)間存在差異。哮喘病呈愈來(lái)愈高發(fā)的趨勢(shì)，但控制狀況欠佳，在國(guó)內(nèi)能夠完善控制哮喘的患者不足3%。因此，對(duì)哮喘控制治療藥物的研制一直都是目前研究的重點(diǎn)。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)以卵蛋白致敏激發(fā)來(lái)制備大鼠哮喘模型，檢測(cè)哮喘組大鼠BALF中細(xì)胞總數(shù)及中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞均明顯高于對(duì)照組，說(shuō)明哮喘大鼠存在氣道高反應(yīng)性及氣道炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；而在哮喘組大鼠肺組織病理中可見(jiàn)顯著的支氣管黏膜、氣道平滑肌增厚、腺體增生、血管壁增厚和血管增生等，符合哮喘病理學(xué)特點(diǎn)的病理改變，說(shuō)明哮喘大鼠模型建立成功。借助圖像分析軟件測(cè)量得出其WAt／Pbm及血管密度均高于對(duì)照組，結(jié)果顯示哮喘大鼠存在氣道重塑和血管重塑。同時(shí)，應(yīng)用免疫組織化學(xué)及ELISA法檢測(cè)大鼠肺組織和血清中的MMP-9和VEGF的表達(dá)水平，哮喘組大鼠肺組織中的MMP-9和VEGF的表達(dá)水平及血清中的VEGF含量較正常對(duì)照組均明顯升高，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。表明哮喘大鼠MMP-9和VEGF的表達(dá)水平升高與其氣道炎癥、氣道高反應(yīng)性及血管重塑、氣道重塑的發(fā)生有關(guān)。

3.2 多西環(huán)素對(duì)VEGF、MMP-9表達(dá)水平的調(diào)節(jié)

多西環(huán)素是一種用途廣泛的抗生素［6］，是四環(huán)素的衍生物。最近研究發(fā)現(xiàn)，四環(huán)素可以抑制基質(zhì)金屬蛋白酶的合成并廣譜抑制基質(zhì)金屬蛋白酶的活性，尤其是對(duì)MMP-2和MMP-9抑制作用更為顯著［7-8］。

Lee等［2］研究了多西環(huán)素對(duì)哮喘小鼠氣道炎癥和氣道高反應(yīng)性的作用，選擇以多西環(huán)素對(duì)進(jìn)行干預(yù)，發(fā)現(xiàn)多西環(huán)素可以減少氣道內(nèi)中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞的數(shù)量，并降低氣道高反應(yīng)性，同時(shí)降低MMP-9mRNA和蛋白的水平。

而在新生血管形成的各種因子中VEGF起著核心作用。VEGF通過(guò)與內(nèi)皮細(xì)胞表面的特異性受體相結(jié)合，不僅可以促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖、增加血管通透性、促進(jìn)新生血管生成，還能促進(jìn)MMP的分泌。同時(shí)從哮喘的發(fā)病機(jī)制上分析，VEGF與 MMP-9尚存在潛在的關(guān)聯(lián)性。目前有研究證實(shí)，哮喘患者痰液中的VEGF和MMP-9水平明顯高于正常人，且二者存在相關(guān)性。在本實(shí)驗(yàn)中通過(guò)免疫組織化學(xué)測(cè)定肺組織中MMP-9、VEGF的表達(dá)水平，同樣發(fā)現(xiàn)哮喘組大鼠MMP-9、VEGF的表達(dá)水平均明顯高于對(duì)照組。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)在特發(fā)性肺間質(zhì)纖維化患者BALF中MMP-9、VEGF的水平較正常人顯著升高，而經(jīng)多西環(huán)素干預(yù)后以上指標(biāo)的水平則可接近正常［9］。本實(shí)驗(yàn)也證實(shí)經(jīng)多西環(huán)素干預(yù)后，MMP-9和VEGF水平較哮喘組均明顯下降。

本實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ徒⒊晒螅ㄟ^(guò)免疫組織化學(xué)及ELISA法測(cè)定MMP-9和VEGF表達(dá)水平，結(jié)果顯示哮喘組MMP-9和VEGF表達(dá)水平明顯升高，應(yīng)用多西環(huán)素干預(yù)后MMP-9和VEGF表達(dá)水平較對(duì)照組稍高，但較哮喘組明顯降低，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。說(shuō)明多西環(huán)素對(duì)降低MMP-9和VEGF的表達(dá)水平具有顯著作用，并由此減輕哮喘氣道重塑及血管重塑程度。這也為哮喘治療提供了新的思路。

綜上所述，氣道炎癥是哮喘的特征之一，血管重塑是氣道重塑的重要部分。MMP-9、VEGF與哮喘炎癥、氣道重塑、血管重塑密切相關(guān)［10］，二者又可相互調(diào)節(jié)。多西環(huán)素可降低MMP-9、VEGF的表達(dá)水平，具有減輕氣道炎癥氣道重塑、血管重塑的作用。關(guān)于MMP-9、VEGF對(duì)哮喘血管重塑作用機(jī)制及多西環(huán)素對(duì)其作用的深入研究也為治療哮喘開(kāi)辟了新的途徑。

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