王錦權(quán)，陶曉根，張霖，劉海華，姚秀英，張興榮，李坤，Li Wei，黃業(yè)華

(1.安徽醫(yī)科大學附屬省立醫(yī)院、安徽省立醫(yī)院，a 南區(qū)重癥醫(yī)學科，b 腎內(nèi)科，合肥 230001；2.UCL School of Pharmacy,University College London)

·基礎研究·

川芎嗪對膿毒癥大鼠肝細胞線粒體體視學的影響

王錦權(quán)1a，陶曉根1a，張霖1a，劉海華1a，姚秀英1a，張興榮1a，李坤1a，Li Wei2，黃業(yè)華1b

(1.安徽醫(yī)科大學附屬省立醫(yī)院、安徽省立醫(yī)院，a 南區(qū)重癥醫(yī)學科，b 腎內(nèi)科，合肥 230001；2.UCL School of Pharmacy,University College London)

[摘要]目的研究川芎嗪(TMP)對膿毒癥大鼠肝細胞線粒體結(jié)構(gòu)的保護作用及可能機制。方法實驗大鼠被分成對照組、膿毒癥組、治療組和預防組；用盲腸結(jié)扎穿孔法制備大鼠膿毒癥實驗模型，在術后10 h，取肝臟標本用JEM-1230透射電子顯微鏡觀察肝細胞的超微結(jié)構(gòu)，選用Image-Pro Plus 6.0圖像軟件對線粒體進行測量；用Western blot技術檢測肝細胞線粒體內(nèi)膜水通道蛋白(AQP)8的表達。結(jié)果和對照組比較，其余3組單個肝細胞切面的線粒體總數(shù)和數(shù)密度均減少(P<0.01)，但治療組和預防組均多于膿毒癥組(P<0.01)；線粒體體積密度膿毒癥組也較對照組低(P<0.01)；線粒體內(nèi)膜AQP8的相對表達量在膿毒癥組、治療組和預防組均較對照組明顯減少(P<0.01)；治療組和預防組的AQP8相對表達量較膿毒癥組增多(P<0.01)。結(jié)論在膿毒癥狀態(tài)下，TMP可保護肝細胞線粒體的結(jié)構(gòu)，可能是通過增加線粒體內(nèi)膜AQP8表達而起作用的。

[關鍵詞]膿毒癥；線粒體,肝;川芎嗪；大鼠,Sprague-Dawley

Effects of tetramethylpyrazine on stereology of hepatocyte mitochondria in septic ratsWangJinquan*,TaoXiaogen,ZhangLin,LiuHaihua,YaoXiuying,ZhangXingrong,LiKun,WeiLi,HuangYehua(*ICU,SouthsideofAnhuiProvincialHospitalAffiliatedtoAnhuiMedicalUniversity,Hefei230001，China)Correspondingauthor:HuangYehua,Email:yehua63@163.com

[Abstract]ObjectiveTo study the protective effects and plausible mechanisms of tetramethylpyrazine(TMP)on the structure of hepatocyte mitochondria in septic rats.MethodsThe rats were randomly divided into four groups:control group,septic group,therapeutic group and prevention group.The model of septic rat was established by the cecal ligation and puncture(CLP).The liver was taken out from septic rat 10 h after CLP,.The ultrastructure of hepatocyte were observed by the JEM-1230 transmission electron microscope.The hepatocyte mitochondria were measured by Image-Pro Plus 6.0 analysis software.The expression of AQP8 was assayed by Western blot.ResultsCompared with the control group,the total number of mitochondria and numberical density were fewer in other 3 groups.The total number of mitochondria and numberical density of septic group were more than the therapeutic and prevention group(P<0.01),but the volume density of septic group was lower than the control group(P<0.01).Compared with the control group,the relative AQP8 protein expression was significantly reduced in the other 3 groups(P<0.01).The AQP8 protein expression of the therapeutic and prevention group were higher than the septic group(P<0.01).ConclusionTMP can protect stereology of hepatocyte mitochondria in septicrats by increasing the expression of AQP8 protein.

[Key words]Sepsis;Mitochondria,liver;Tetramethylpyrazine；Rats,sprague-dawley

線粒體功能障礙和由此引起的細胞能量代謝衰竭是膿毒癥介導多器官功能衰竭的主要病理機制之一[1]；肝細胞線粒體損傷可導致肝臟能量代謝和解毒、合成等功能障礙，并最終引起肝功能不全甚至衰竭[2]。對線粒體的保護和通過刺激線粒體生物發(fā)生(新蛋白轉(zhuǎn)換)加速病情恢復是目前膿毒癥研究的熱點問題之一[3]。川芎嗪的有效成分是四甲基吡嗪(TMP)，研究證明TMP對膿毒癥引起的急性肝損傷具有保護作用，可維持肝細胞結(jié)構(gòu)的完整性[4]。本研究通過對膿毒癥大鼠肝細胞線粒體的體視學研究，分析TMP對線粒體形態(tài)和線粒體內(nèi)膜水通道蛋白(AQP)8表達的影響。

1材料與方法

1.1實驗動物選擇清潔級SD大鼠48只，雌雄各半，體質(zhì)量160~200 g,由安徽醫(yī)科大學實驗動物中心提供[合格證號：SCXK(皖)2005-001]。SD大鼠被隨機分為4組，對照組、膿毒癥組、治療組和預防組；膿毒癥大鼠模型使用盲腸結(jié)扎穿孔(CLP)法制備，膿毒癥組大鼠僅進行CLP手術；治療組大鼠在完成CLP術后，立即從尾靜脈注射鹽酸川芎嗪注射液(無錫市第七制藥有限公司生產(chǎn))，劑量為60 mg/kg[5]；預防組大鼠在尾靜脈注射60 mg /kg鹽酸川芎嗪注射液7 d后[6]，接受CLP術；對照組大鼠進行假手術。實驗分2部分進行，第1部分，每組12只大鼠，每次實驗從4組中各取1只，觀察手術時間、手術結(jié)束至出現(xiàn)膿毒癥的時間和實驗動物存活時間。膿毒癥診斷標準：肛溫<36 ℃或>38 ℃、觸摸大鼠的警覺性下降、腹瀉、眼睛出血、立毛等[7]。第2部分，每組12只大鼠，每次實驗從4組中各取1只，在CLP術后10 h，用苯巴比妥腹腔注射麻醉后處死實驗大鼠，肝臟被快速取出置于0 ℃緩沖液中。

1.2線粒體的體視學觀察依據(jù)體視學四級取樣法[8]，于肝臟左中葉距下緣約0.5 cm處切取約1 mm3的肝組織10余塊，常規(guī)2.5%的戊二醛固定后隨機選取3塊組織，經(jīng)鋨酸固定，逐級酒精脫水、包埋，制成50 nm超薄切片。經(jīng)4%的醋酸鈾酰和0.5%的醋酸鉛雙重染色后，用JEM-1230透射電子顯微鏡(日本電子株式會社)觀察肝細胞線粒體的超微結(jié)構(gòu)。對每只實驗大鼠肝臟標本觀察50個肝細胞，從中隨機選取12個肝細胞電鏡圖片，放大5 000倍，計算每個肝細胞切面的線粒體總數(shù)；再放大10 000倍，分析計算每個肝細胞切面的線粒體數(shù)密度(Nv)、表面積密度(Sv)和體積密度(Vv)。Nv反映單位體積內(nèi)線粒體的數(shù)量，Nv越大，表明線粒體數(shù)量越多； Sv反映單位體積內(nèi)線粒體的表面積大小，與線粒體的數(shù)量、大小和形狀有關； Vv反映單位體積細胞內(nèi)線粒體體積，與線粒體的體積、數(shù)量和大小有關[9]。用Image-Pro Plus 6.0圖像軟件進行測量[10]。

1.3線粒體內(nèi)膜AQP8蛋白檢測[4]將肝組織剪碎，用電動勻漿器勻漿；使用差速離心法分離線粒體，線粒體用分離介質(zhì)稀釋后備用。制備線粒體的裂解液，用Western blot技術檢測線粒體膜AQP8的相對表達量。AQP8相對表達量=AQP8條帶灰度/β-肌動蛋白條帶灰度×100%；再以對照組AQP8相對表達量為100%，余三組的AQP8蛋白相對表達量=各組實際AQP8蛋白相對表達量/對照組AQP8蛋白相對表達量×100%。用Image-pro Plus 6.0軟件計算。

1.4統(tǒng)計學處理用SPSS17.0進行統(tǒng)計學分析，用獨立樣本t檢驗和單因素方差分析進行統(tǒng)計學處理。

2結(jié)果

2.1手術結(jié)束至出現(xiàn)膿毒癥的時間和實驗動物存活時間比較對照組大鼠存活時間均大于48 h；膿毒癥組大鼠術后出現(xiàn)膿毒癥的時間較治療組和預防組的大鼠短(P<0.01)；治療組和預防組大鼠的存活時間較膿毒癥組大鼠長(P<0.01)；治療組和預防組比較術后出現(xiàn)膿毒癥的時間和存活時間差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。對照組大鼠手術時間較另三組明顯縮短(P<0.01)，手術時間在膿毒癥組、治療組和預防組間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表1。

表1　各組手術時間、術后出現(xiàn)膿毒癥時間和存活時間

注：與對照組比較,aP<0.01;與膿毒癥組比較,bP<0.01

2.2線粒體的體視學比較膿毒癥狀態(tài)下肝細胞線粒體形態(tài)發(fā)生了顯著改變，線粒體體積增大，嵴腫脹明顯、空泡樣變，可見部分線粒體外膜破裂，發(fā)生脂肪變性(見圖1)。和對照組比較，膿毒癥組、治療組和預防組的單個肝細胞切面線粒體總數(shù)和Nv均減少(P<0.01)，但治療組和預防組均多于膿毒癥組(P<0.01)；膿毒癥組Vv也較對照組較少(P<0.01)，治療組和預防組和對照組間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；但Sv各組間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見圖2，表2。

表2　肝細胞切面線粒體總數(shù)、Nv和Sv和Vv的比較

注：與對照組比較,aP<0.01;與膿毒癥組比較,bP<0.01

2.3AQP8的表達線粒體內(nèi)膜AQP8的相對表達量，和對照組相比，膿毒癥組、治療組及預防組明顯減少(P<0.01)，治療組和預防組較膿毒癥組顯著增多(P<0.01)，而治療組和預防組之間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),見圖3。

3討論

在膿毒癥狀態(tài)下，氧化與還原失衡和全身性炎性反應可引起進行性線粒體衰竭、能量耗竭、組織缺氧、感染性休克、多器官功能障礙，直至患者死亡[11]。線粒體功能障礙促進了膿毒癥介導的器官功能不全的發(fā)展，線粒體形態(tài)改變是其病理特征之一[12]；器官功能恢復也依賴于線粒體功能的恢復，保護線粒體結(jié)構(gòu)和恢復線粒體功能將會為重要臟器功能保護和多器官功能衰竭的治療提供一種新的理念[13]。研究發(fā)現(xiàn)，膿毒癥引起的急性肝損傷，TMP對肝細胞線粒體結(jié)構(gòu)的完整性和功能均具有保護作用[14-15]，該作用可能是通過上調(diào)肝細胞線粒體內(nèi)膜的AQP8表達來實現(xiàn)的[4]。本研究通過TMP對膿毒癥大鼠預后、線粒體體視學及線粒體內(nèi)膜AQP8表達的影響，探討TMP對肝細胞線粒體結(jié)構(gòu)完整性的保護作用并分析其機制。

3.1川芎嗪對膿毒癥大鼠預后的影響本研究發(fā)現(xiàn)，治療組和預防組大鼠手術結(jié)束至出現(xiàn)膿毒癥的時間較膿毒癥組長(P<0.01)，即TMP可以延緩實驗大鼠膿毒癥發(fā)作的時間；治療組和預防組大鼠的存活時間也較膿毒癥組大鼠長(P<0.01)，與Guo等[16]研究結(jié)果一致；提示TMP可以延緩膿毒癥大鼠的重要臟器損害，為原發(fā)病治療贏得時間。治療組和預防組實驗大鼠的術后出現(xiàn)膿毒癥時間和存活時間比較差異均無統(tǒng)計學意義，提示用TMP預防膿毒癥發(fā)生和發(fā)展臨床意義并不大。

3.2川芎嗪對線粒體的體視學影響本研究中，膿毒癥時線粒體形態(tài)發(fā)生明顯變化，線粒體的體積增大，嵴腫脹明顯、空泡樣變，直至線粒體外膜破裂，發(fā)生脂肪變性。膿毒癥組、治療組和預防組單個肝細胞切面的線粒體總數(shù)和Nv較對照組明顯減少(P<0.01)，但治療組和預防組的線粒體總數(shù)和Nv多于膿毒癥組(P<0.01)；提示膿毒癥狀態(tài)下，肝細胞內(nèi)線粒體的數(shù)量減少明顯；TMP治療可以減輕線粒體結(jié)構(gòu)破壞，減少脂肪變性的發(fā)生，對線粒體具有保護作用。線粒體Vv在膿毒癥組也較對照組小(P<0.01)，與線粒體發(fā)生脂肪變性后其數(shù)量減少有關；治療組及預防組和對照組間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，是由于治療組及預防組線粒體數(shù)量雖有減少，但線粒體腫脹程度加大，體積增大，導致Vv減少并不明顯。線粒體的Sv在4組間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，這與Sv的計算方式有關；膿毒癥組肝細胞內(nèi)線粒體的分布是不均衡的，盡管線粒體的數(shù)量減少，但Sv計算必須要在有完整線粒體的局部區(qū)域進行，加之線粒體腫脹，體積增大，因而在Sv這一指標上4組間差異并不明顯；相關研究也有類似情況報告[17]。

3.3川芎嗪對線粒體內(nèi)膜AQP8表達的影響和對照組比較，線粒體內(nèi)膜AQP8的相對表達量在膿毒癥組、治療組和預防組均降低(P<0.01)；治療組和預防組的線粒體AQP8表達量較膿毒癥組增多(P<0.01)，治療組和預防組之間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。研究表明在肝臟線粒體內(nèi)膜的AQP8通道能透過水和氨，并且AQP8起著水合作用并參與線粒體代謝[18]。而膿毒癥組大鼠的AQP8表達顯著降低，認為AQP8表達下調(diào)導致線粒體內(nèi)水的轉(zhuǎn)運障礙，線粒體內(nèi)滲透壓發(fā)生改變，引起的線粒體腫脹，病情進一步發(fā)展出現(xiàn)線粒體外膜破裂和脂肪變性。盡管膿毒癥組大鼠單個肝細胞切面線粒體總數(shù)和Nv減少，因檢測AQP8制備裂解液使用的線粒體蛋白濃度相同，不認為是由于線粒體數(shù)量減少而引起的AQP8量降低。TMP對肝細胞線粒體結(jié)構(gòu)的保護作用機制可能是通過上調(diào)AQP8表達來實現(xiàn)的。

綜上所述，膿毒癥介導的器官損傷早期特征是沒有細胞死亡和結(jié)構(gòu)損傷的功能障礙，此時給予有效治療，機體尚具有恢復器官功能的能力[19]。膿毒癥介導的急性肝損傷病理過程中，線粒體是早期受損的細胞器之一，線粒體正常功能依賴于膜結(jié)構(gòu)的高度完整性[20]。川芎嗪通過上調(diào)線粒體內(nèi)膜AQP8表達而起到保護線粒體結(jié)構(gòu)完整性的作用，對膿毒癥介導的急性肝損傷起到保護作用；調(diào)節(jié)線粒體內(nèi)膜AQP8含量來改變線粒體形態(tài)學是一種全新的治療理念。

(本文圖1~3見插圖4-3)

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(收稿日期：2015-05-30)

通信作者：黃業(yè)華，主任醫(yī)師，教授，Email:yehua63@163.com

作者簡介：王錦權(quán)，博士，主任醫(yī)師，Email:jqwang604@163.com

基金項目：安徽省國際合作項目(1403062022)

中圖分類號：R631

文獻標識碼：A

DOI:10.3969/J.issn.1672-6790.2015.04.020