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        電針對(duì)腦缺血大鼠海馬神經(jīng)元凋亡的影響

        2015-03-14 02:48:20鄭彩霞韓肖華黃曉琳郭雅碧
        中國(guó)康復(fù) 2015年5期
        關(guān)鍵詞:側(cè)腦室腦缺血電針

        鄭彩霞,韓肖華,黃曉琳,郭雅碧

        國(guó)際阿爾茨海默氏病聯(lián)盟(Alzheimer's Disease International,ADI)統(tǒng)計(jì)表明:截止2013年,全世界范圍內(nèi)癡呆患者達(dá)到4 440萬(wàn),預(yù)計(jì)到2050年,癡呆患者將超過(guò)13 550萬(wàn)。血管性癡呆(vascular dementia,VaD)占癡呆總數(shù)的20%~30%,是僅次于阿爾茨海默氏病(Alzheimer's disease,AD)的第2大癡呆類(lèi)型[1]。針灸作為替代療法對(duì)VaD的改善作用在中西方已經(jīng)得到越來(lái)越多的實(shí)驗(yàn)證實(shí)[2-3],但其具體機(jī)制尚不明確。韓肖華等[4]發(fā)現(xiàn)電針(electroacupuncture,EA)刺激百會(huì)穴和大椎穴7d可促進(jìn)腦缺血大鼠海馬蛋白激酶A-環(huán)磷酸腺苷反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(protein kinase A-cAMP response element binding protein,PKA-CREB)信號(hào)通路激活,使磷酸化環(huán)磷酸腺苷反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(phosphorylated cAMP-response element binding protein,pCREB)和Bcl-2蛋白量升高,Bax蛋白量下降,Morris水迷宮成績(jī)提高。在以上研究基礎(chǔ)上,本實(shí)驗(yàn)設(shè)置術(shù)后7d、14d、21d 3個(gè)時(shí)間點(diǎn),通過(guò)延長(zhǎng)觀察時(shí)間,進(jìn)一步探討電針對(duì)腦缺血大鼠海馬神經(jīng)元凋亡的影響及可能內(nèi)在機(jī)制。

        1 材料與方法

        1.1 材料 ①實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:SPF(Specefic pathogen Free)級(jí)成年SD(Sprague-Dawley)雄性大鼠90只,體質(zhì)量250±20g,由湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供(許可證號(hào):SCXK(湘)2011-0003)。②主要試劑:PKA選擇性抑制劑H89(Sigma公司)、TUNEL試劑盒(Roche公司)、兔抗大鼠Bcl-2單克隆抗體(Cell Signaling Technology公司)、兔抗大鼠Bax單克隆抗體(Abcam公司)、兔抗大鼠GAPDH多克隆抗體(Abcam公司)、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔二抗(KPL公司)、DAB顯色試劑盒(武漢博士德生物技術(shù)公司)。③主要材料與儀器:PVDF膜(Millipore公司),電針儀(上海G6805-II型)、毫針(華佗牌,30號(hào))、腦立體定位儀、微量注射器、尼康E100型生物顯微鏡、佳能600D相機(jī)。

        1.2 方法 ①分組及處理:90只大鼠隨機(jī)分為5組:假手術(shù)組、模型組、電針組、電針+H89組和電針+NS組各18只,每組又分成7d、14d、21d 3個(gè)亞組(n=6),每組其中3只新鮮取材后用于Western blotting檢測(cè),另外3只灌注后用于原位末端轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記技術(shù)(terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP-biotin nick end labeling,TUNEL)檢測(cè)。②側(cè)腦室注射:電針+H89組和電針+NS組大鼠分別側(cè)腦室注射H89(2μg/μL)或NS 10 μL后再制作腦缺血模型。側(cè)腦室定位坐標(biāo):前囟后0.8mm,前囟右側(cè)1.5mm,硬腦膜下約4.0mm。第14d、21d組大鼠每間隔1周重復(fù)側(cè)腦室注射H89或NS一次。③造模:制備雙側(cè)頸總動(dòng)脈永久性結(jié)扎(2-vessel occlusion,2VO)模型:鈍性分離頸總動(dòng)脈后分別結(jié)扎近端和遠(yuǎn)端并剪斷中部;假手術(shù)組大鼠僅分離雙側(cè)頸總動(dòng)脈但不接扎和剪斷。④電針治療:電針組、電針+H89組和電針+NS組大鼠于造模次日開(kāi)始接受電針治療。參照《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》[5],“百會(huì)”穴位于頂骨正中,“大椎”穴位于背部正中第7頸椎與第1胸椎間。用針灸毫針斜刺入“百會(huì)”1cm, 直刺入“大椎”0.5cm后連接上海G6805-II型電針儀,“百會(huì)”接負(fù)極,“大椎”接正極,選取連續(xù)波,頻率20Hz,強(qiáng)度以觀察到大鼠眼瞼輕微顫動(dòng)為宜,每天1次,每次20min,根據(jù)分組分別連續(xù)治療7d、14d或21d。假手術(shù)組及模型組大鼠術(shù)后常規(guī)飼養(yǎng),無(wú)其他特殊處理。

        1.3 評(píng)定標(biāo)準(zhǔn) ①組織切片:10%水合氯醛3ml/kg腹腔注射麻醉大鼠后,經(jīng)心臟依次快速灌注生理鹽水250ml及4%多聚甲醛250ml,斷頭取腦后置于4%多聚甲醛中后固定24h,常規(guī)脫水、透明、浸蠟及包埋。按照《大鼠腦立體定位圖譜》在海馬典型位置連續(xù)冠狀切片(厚度4μm)[6],每間隔12μm留取1張切片,每個(gè)腦組織取3張切片用于TUNEL檢測(cè)。②TUNEL檢測(cè):實(shí)驗(yàn)步驟按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。在400倍光學(xué)顯微鏡下,每張切片分別拍攝雙側(cè)海馬CA1區(qū),每側(cè)CA1區(qū)隨機(jī)選取2個(gè)視野拍照。采用Image-Pro Plus軟件計(jì)數(shù)各視野下凋亡細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞總數(shù),并計(jì)算凋亡細(xì)胞所占比率,以上述4個(gè)視野下凋亡細(xì)胞率的均值作為該大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元凋亡細(xì)胞率的值。③蛋白免疫印跡(Western blotting):10%水合氯醛3ml/kg腹腔注射麻醉大鼠后,直接斷頭取腦并迅速分離出海馬組織。取1/2海馬組織塊與裂解液混合并勻漿,離心(4℃,14000g,20min)后,提取總蛋白液。上樣量60μg,行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electropheresis,SDS-PAGE)(濃縮80V 30min;分離120V 90min)和轉(zhuǎn)膜(200mA 70min),再先后孵育一抗(1∶2000,4℃,12h)和二抗(1∶10000,室溫,2h);經(jīng)X膠片曝光顯像,采用Image-J軟件分析目標(biāo)蛋白及內(nèi)參蛋白的灰度值并計(jì)算比值。

        2 結(jié)果

        各組大鼠組內(nèi)3個(gè)時(shí)間點(diǎn)間的海馬神經(jīng)元凋亡率相比,模型組14d組、21d組較7d組顯著增加(P<0.05);其余各組各時(shí)間點(diǎn)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)量比較,電針組21d組較14d組Bcl-2蛋白量顯著增多(P<0.05)。其余各組各個(gè)評(píng)價(jià)指標(biāo)在3個(gè)時(shí)間點(diǎn)比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。同時(shí)間點(diǎn)各組大鼠間海馬神經(jīng)元凋亡率比較,模型組較假手術(shù)組均顯著增加(P<0.05);電針組較模型組均顯著降低(P<0.05);電針+H89組較電針+NS組均顯著增多(P<0.05)。同時(shí)間點(diǎn)各組大鼠間的凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)量比較,模型組較假手術(shù)組Bax蛋白量均顯著增高(P<0.05),而B(niǎo)cl-2蛋白量均顯著降低(P<0.05);電針組較模型組Bax蛋白量均顯著降低(P<0.05),而B(niǎo)cl-2蛋白量均顯著增加(P<0.05);電針+H89組較電針+NS組Bax蛋白量均明顯增多(P<0.05),而B(niǎo)cl-2蛋白量明顯降低(P<0.05),但在14d時(shí)2組Bcl-2蛋白表達(dá)差異無(wú)顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)圖1及表1。

        圖1 各組大鼠海馬區(qū)Bax蛋白、Bcl-2蛋白的表達(dá)

        a.假手術(shù)組;b.模型組;c.電針組;d.電針+H89組;e.電針+NS組

        表1 各組大鼠海馬神經(jīng)元凋亡率、Bax蛋白相對(duì)表達(dá)量、Bcl-2蛋白相對(duì)表達(dá)量比較

        與同組7d比較,aP<0.05;與同組14d比較,bP<0.05;與同時(shí)間點(diǎn)假手術(shù)組比較,cP<0.05;與同時(shí)間點(diǎn)模型組比較,dP<0.05;與同時(shí)間點(diǎn)電針+NS組比較,eP<0.05

        3 討論

        慢性腦低灌注是VaD和AD患者發(fā)生認(rèn)知功能下降的基本發(fā)病機(jī)制之一[7],大鼠2VO模型常用于模擬人類(lèi)大腦慢性低灌注病變。在該模型中,海馬CA1區(qū)神經(jīng)元丟失隨缺血時(shí)間延長(zhǎng)逐漸加重,在術(shù)后2周[8]、4周[8]和8~13周[9],分別有6%~29%、55%和67%的大鼠出現(xiàn)海馬結(jié)構(gòu)破壞,這與本實(shí)驗(yàn)中模型組7d、14d、21d神經(jīng)元凋亡率逐漸加重的結(jié)果相一致。腦缺血后機(jī)體PKA-CREB信號(hào)通路可被激活[2],可通過(guò)調(diào)控多種靶基因的轉(zhuǎn)錄而力圖減輕腦缺血缺氧引起的神經(jīng)功能失穩(wěn)和認(rèn)知功能下降,其中Bcl-2[10]、BDNF等基因與神經(jīng)元存活密切相關(guān)[10-11]。Bcl-2蛋白是中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)主要的抗凋亡蛋白,而B(niǎo)ax蛋白會(huì)促進(jìn)凋亡[12]。在本實(shí)驗(yàn)中,3個(gè)時(shí)間點(diǎn)模型組與假手術(shù)組相比,Bax蛋白量顯著升高,伴有Bcl-2蛋白量顯著降低,可能是模型組海馬CA1區(qū)海馬神經(jīng)元凋亡率顯著升高的內(nèi)在機(jī)制之一。

        電針具有抗腦缺血后細(xì)胞凋亡的作用。陶靜等[13]研究表明電針可抑制局灶性腦缺血再灌注損傷大鼠腦組織中Bax蛋白表達(dá),提高Bcl-2、BDNF蛋白表達(dá),加速神經(jīng)功能恢復(fù)。余茜等[14]研究表明電針可上調(diào)右側(cè)大腦中動(dòng)脈缺血模型大鼠海馬Bcl-2蛋白表達(dá)、下調(diào)Bax蛋白表達(dá)而促進(jìn)腦梗死大鼠行為能力恢復(fù)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果中,電針組較模型組神經(jīng)元凋亡率和Bax蛋白量均顯著下降,同時(shí)Bcl-2蛋白量均顯著升高,提示電針可以明顯改善腦缺血后神經(jīng)元凋亡反應(yīng)。但同時(shí),分別電針治療7d、14d、21d 的三組大鼠海馬神經(jīng)元凋亡率仍然呈增加的趨勢(shì),分析可能原因:持續(xù)性腦流量下降發(fā)生15~20min后神經(jīng)元開(kāi)始發(fā)生不可逆性損傷[15],并且隨缺血缺氧時(shí)間延長(zhǎng)神經(jīng)元病變范圍和程度會(huì)進(jìn)行性加重,盡管電針組較同時(shí)間點(diǎn)模型組凋亡進(jìn)展的嚴(yán)重程度已經(jīng)顯著緩解,但并不能逆轉(zhuǎn)或者完全遏制凋亡反應(yīng)逐漸加重的趨勢(shì)。同時(shí)我們還發(fā)現(xiàn),Bcl-2蛋白量在電針組21d組較14d組顯著增加,提示增加電針療程可能對(duì)神經(jīng)元的保護(hù)作用更明顯。

        H89是蛋白激酶A(protein kinase A,PKA)的選擇性抑制劑,在電針治療前側(cè)腦室注射H89組與NS組的大鼠相比,神經(jīng)元凋亡率和Bax蛋白表達(dá)均顯著增加,伴有Bcl-2蛋白表達(dá)顯著下降,說(shuō)明電針的抗神經(jīng)元凋亡作用被抑制,反向驗(yàn)證了電針的內(nèi)在機(jī)制之一可能與激活PKA-CREB通路相關(guān)。電針+H89組與電針+NS組在14d時(shí)Bcl-2蛋白量無(wú)顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,可能有以下原因:①多種激酶[如Ca2+/鈣調(diào)蛋白激酶IV(Calcium/calmodulin-dependent protein kinase type IV,CaMK IV)]都能磷酸化CREB[16],當(dāng)CaMK IV激活CREB后也可以調(diào)控Bcl-2基因的表達(dá),此時(shí)H89不能阻斷其他激酶對(duì)CREB及Bcl-2基因的作用;②后續(xù)如果增加14d、21d組的樣本量,實(shí)驗(yàn)結(jié)果可能更有說(shuō)服性。

        綜上所述,電針刺激百會(huì)穴和大椎穴7d、14d和21d均可以明顯減輕腦缺血后海馬神經(jīng)元凋亡,其內(nèi)在機(jī)制可能與激活PKA-CREB信號(hào)通路后調(diào)節(jié)Bax蛋白、Bcl-2蛋白表達(dá)相關(guān)。本研究結(jié)果提示PKA-CREB信號(hào)通路可能是電針的作用機(jī)制之一,但電針是否影響該信號(hào)通路上其他基因的調(diào)控有待進(jìn)一步研究。

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