林萍，鄧濤，葉彥，汪維波，劉苗，羅和生

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論著·基礎

人結(jié)直腸癌組織中mTOR、HIF-1α、PKM2的表達 及臨床意義

林萍，鄧濤，葉彥，汪維波，劉苗，羅和生

目的 觀察人體結(jié)直腸癌組織中哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)、低氧誘導因子-1α(HIF-1α)和酪氨酸激酶M2(PKM2)的表達，并探討其臨床意義。方法 外科手術(shù)及纖維結(jié)腸鏡切除并經(jīng)病理確診的結(jié)直腸癌標本87例為結(jié)直腸癌組，正常結(jié)直腸組織30例為正常結(jié)直腸組，運用免疫組化方法檢測其mTOR、HIF-1α、PKM2的表達。結(jié)果 結(jié)直腸癌組mTOR、HIF-1α及PKM2的平均光密度值均顯著高于正常結(jié)直腸組(分別為5 165.6±391.8vs. 1 215.8±153.4，4 474.4±255.9vs. 1 633.0±115.6，9 736.0±128.7vs. 4 031.8±477.1，P<0.05)。結(jié)直腸癌患者不同性別、年齡、分化程度下mTOR、HIF-1α及PKM2表達率無統(tǒng)計學差異(P>0.05)；不同Dukes分期和淋巴轉(zhuǎn)移下mTOR、HIF-1α及PKM2的表達率有統(tǒng)計學差異(P<0.05)；不同浸潤深度下mTOR和PKM2的表達率有統(tǒng)計學差異(P<0.05)，而HIF-1α表達率差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。結(jié)直腸癌組織中mTOR與HIF-1α、PKM2蛋白間呈正相關(guān)(r=0.247、0.512，P<0.05)，且HIF-1α與PKM2亦呈正相關(guān)(r=0.568，P<0.05)。結(jié)論 人體結(jié)直腸癌組織中mTOR、HIF-1α及PKM2的相對表達量均顯著高于非腫瘤人群，且其表達與結(jié)直腸癌的增殖轉(zhuǎn)移相關(guān)，可作為結(jié)直腸癌靶向治療作用位點。

結(jié)直腸癌；酪氨酸激酶;雷帕霉素靶蛋白；低氧誘導因子-1α；免疫組化

【DOI】 10.3969 /j.issn.1671-6450.2015.04.015

結(jié)直腸癌是常見的惡性腫瘤之一，具有較高的發(fā)病率及病死率[1，2]。目前大部分結(jié)直腸癌雖可進行手術(shù)治療，卻無法明確改善治療效果和預后。結(jié)直腸癌的轉(zhuǎn)移是影響其治療效果及預后的重要因素。結(jié)直腸癌細胞的快速增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移與其獨特的能量代謝密切相關(guān)[3]，即正常的細胞只有在缺氧的條件下才進行糖酵解，而腫瘤細胞即使在有氧的條件下也優(yōu)先進行糖酵解，消耗葡萄糖，產(chǎn)生乳酸，這就是Warburg效應[4]。Warburg效應在胚胎細胞及惡性腫瘤細胞中發(fā)生，有研究表明部分腫瘤細胞利用有氧糖酵解合成的三磷酸腺苷(ATP)可達到總量的60%[5]。腫瘤細胞利用Warburg效應來獲取足夠的能量及其他生物大分子，因此干擾這一效應是治療腫瘤的新方向。研究腫瘤細胞糖酵解相關(guān)蛋白的表達，探討其在結(jié)直腸癌早期發(fā)現(xiàn)、動態(tài)監(jiān)測、療效評價及預后評估上的作用是目前研究的焦點所在。本研究主要采用免疫組織化學技術(shù)檢測糖酵解相關(guān)蛋白mTOR、HIF-1α及PKM2在結(jié)直腸癌組織中的表達，以探討其在結(jié)直腸癌增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移過程中的意義。

1 材料與方法

1.1 標本來源 2013年1—12月武漢大學人民醫(yī)院胃腸外科結(jié)直腸癌患者手術(shù)切除、并經(jīng)病理確診的結(jié)直腸癌標本87例作為結(jié)直腸癌組，納入研究的全部患者術(shù)前均未進行放療、化療及生物治療。男47例，女40例， 平均年齡(58.2±11.1)歲。(1)浸潤深度：黏膜下層或肌層20例，漿膜層或漿膜外層67例；(2)分化程度：高分化26例，中分化53例，低分化8例；(3)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移：有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者42例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者45例；(4)腫瘤Dukes分期：A期17例，B期29例，C期39例，D期2例。另外從武漢大學人民醫(yī)院消化內(nèi)鏡中心收集纖維結(jié)腸鏡活檢標本中正常結(jié)直腸黏膜組織30例，作為正常結(jié)直腸組。

1.2 主要試劑 mTOR (7C10) Rabbit mAb、Hydroxy-HIF-1α (Pro564) Rabbit mAb及PKM2 (D78A4) XP?Rabbit mAb單克隆抗體均購自Cell Signaling Technology公司，免疫組化SP試劑盒及DAB顯色劑均購自武漢博士德公司。

1.3 mTOR、HIF-1α、PKM2檢測方法 采用免疫組化法進行檢測：標本收集后即進行分類整理，先將組織標本浸入10%福爾馬林溶液中進行器官組織的固定，3 d后取出固定好的組織進行石蠟包埋、4 μm連續(xù)切片。石蠟切片經(jīng)過常規(guī)脫蠟、水化，微波加熱修復抗原，試劑盒A液100～400 μl封閉非特異性抗原，室溫下處理1 h，移走封閉液再加入100～400 μl稀釋后的一抗在4℃冰箱中孵育過夜；再滴加稀釋后的二抗(100～400 μl) 室溫孵育30 min；以上各步驟均用0.01 mol/L、pH 7.4 PBS緩沖液振洗5 min×3次；加DAB顯色，于顯微鏡下觀察，蒸餾水終止，蘇木精復染10 s，蒸餾水沖洗，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，樹膠封片。以PBS取代一抗作陰性對照，用已知陽性對照圖片作陽性對照。

1.4 結(jié)果判斷 Olympus BX50系統(tǒng)顯微鏡(日本奧林巴斯公司)下觀察染色結(jié)果，細胞漿、胞膜或胞核中見棕黃色染色顆粒者即為陽性細胞。每組每個指標隨機抽取20例樣本進行分析，每個樣本顯微鏡下隨機選擇4～6個高倍視野(×200) 進行拍照，應用Media Cybernetics公司的Image-Pro Plus圖像分析軟件分析評價光密度值(optical density average)并配對比較其差異。

2 結(jié) 果

2.1mTOR、HIF-1α、PKM2的表達mTOR陽性染色表現(xiàn)為棕黃色顆粒彌漫性分布于整個胞漿，結(jié)直腸癌組織的平均光密度值為(5 165.6±391.8)，正常結(jié)直腸黏膜組織為(1 215.8±153.4)；HIF-1α陽性染色主要表現(xiàn)為胞質(zhì)或胞核為棕黃色，于腫瘤壞死明顯處和腫瘤浸潤邊緣的表達量明顯增多，結(jié)直腸癌組織的平均光密度值為(4 474.4±255.9)，正常結(jié)直腸黏膜組織為(1 633.0±115.6)；PKM2陽性染色主要表現(xiàn)為棕黃色顆粒彌漫性分布于整個胞漿或呈線性分布于核膜周邊，結(jié)直腸癌組織的平均光密度值為(9 736.0±128.7)，正常結(jié)直腸黏膜組織為(4 031.8±477.1)。mTOR、HIF-1α及PKM2在結(jié)直腸癌組織表達的平均光密度值均顯著高于正常結(jié)直腸組織(P<0.05)。見表1。圖1，2見封3。

表1 mTOR、HIF-1α及PKM2在結(jié)直腸癌和正常 結(jié)直腸組織中的平均光密度值±s)

2.2mTOR、HIF-1α和PKM2在結(jié)直腸癌組織中表達與臨床特征之間的關(guān)系 將結(jié)直腸癌患者依據(jù)性別、年齡、有無淋巴轉(zhuǎn)移、浸潤深度、分化程度及分期等臨

表2 結(jié)直腸癌不同臨床特征下mTOR、HIF-1α、PKM2表達率的比較 [例(%)]

床特征進行分組，結(jié)果發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌患者在不同性別、年齡及分化程度下mTOR、HIF-1α和PKM2的表達率無統(tǒng)計學差異(P>0.05)；在不同Dukes分期、淋巴轉(zhuǎn)移下mTOR、HIF-1α和PKM2的表達率差異有統(tǒng)計學意義(P﹤0.05)；不同浸潤深度下mTOR、PKM2的表達率有統(tǒng)計學差異(P﹤0.05)，而HIF-1α的表達率無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。見表2。

2.3mTOR、HIF-1α和PKM2蛋白表達的相關(guān)性分析 結(jié)直腸癌組織中mTOR與HIF-1α和PKM2蛋白間呈正相關(guān)(r=0.247、0.512，P﹤0.05)，且HIF-1α與PKM2亦呈正相關(guān)(r=0.568，P<0.05)。

3 討 論

20世紀20年代生物化學家Warburg首次提出了存在于腫瘤細胞中的特殊代謝方式，即使在有氧的條件下也優(yōu)先進行糖酵解，消耗葡萄糖、產(chǎn)生乳酸，而正常的細胞在氧氣充足的情況下會進行葡萄糖的有氧氧化來獲取能量，僅僅于缺氧的條件下才進行糖酵解，即Warburg效應，由此引起了有關(guān)腫瘤代謝機制方面研究的熱潮[6]。

mTOR是磷脂酰肌醇激酶相關(guān)激酶超家族的一員，作為絲/蘇氨酸激酶而起作用，其底物主要是控制與細胞生長和增殖密切相關(guān)的一系列蛋白的合成[7]。mTOR是調(diào)控細胞生長信號和調(diào)節(jié)細胞周期的匯聚點，集聚了來自于細胞內(nèi)外的營養(yǎng)、能量、生長因子和環(huán)境調(diào)節(jié)信號，通過其下游的效應器調(diào)控細胞的生長，調(diào)節(jié)周期進程，并在細胞分化及凋亡方面起控制作用[8，9]。在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中，與mTOR相關(guān)的信號通路被過度激活，引起細胞周期調(diào)節(jié)失控，進而對細胞轉(zhuǎn)化和腫瘤進展進行調(diào)控[10]。在多種腫瘤中(包括腎癌、胃癌和肝癌等)mTOR過度表達[11]，抑制mTOR表達及其介導的信號通路現(xiàn)已成為腫瘤監(jiān)測和治療的熱點。本結(jié)果發(fā)現(xiàn)mTOR在結(jié)直腸癌組織中的表達明顯高于正常結(jié)直腸黏膜組織，表明mTOR在結(jié)直腸癌的發(fā)病過程中起重要作用；且mTOR的高表達與腫瘤浸潤深度、淋巴轉(zhuǎn)移和臨床分期均顯著相關(guān)，提示mTOR的高表達與結(jié)直腸癌的進展高度相關(guān)。

在多數(shù)腫瘤細胞中，HIF-1α和部分糖酵解關(guān)鍵酶的表達都是升高的，HIF-1α可調(diào)控一些與缺氧反應有關(guān)的基因，以及與糖酵解反應有關(guān)的關(guān)鍵酶，如醛縮酶A、丙酮酸激酶、磷酸甘油酸激酶1等的表達，但調(diào)節(jié)的具體機制目前尚不清楚[12，13]。一般情況下，HIF-1α只有在缺氧的條件下才會上調(diào)以適應和調(diào)節(jié)機體的應激反應，而過度活化的mTOR在氧氣充足的條件下也可從轉(zhuǎn)錄水平激活HIF-1α的表達[14，15]。HIF-1α的表達發(fā)生于結(jié)直腸癌增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移的全過程，通過增加腫瘤細胞對組織低氧和低能量物質(zhì)供應的適應能力，從而促進結(jié)直腸癌的發(fā)生與發(fā)展[16]。此次實驗發(fā)現(xiàn)HIF-1α在結(jié)直腸癌組織中的表達量與正常結(jié)直腸黏膜組織比較，差異有統(tǒng)計學意義，且HIF-1α的表達與腫瘤的臨床分期、淋巴轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)，表明HIF-1α在結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展中扮演重要的角色。

PKM2是一種丙酮酸激酶同工酶，表達于人體生長發(fā)育過程中的胚胎期，然而其在增殖旺盛的細胞，如腫瘤細胞中會再次表達。PKM2的高表達調(diào)控著腫瘤細胞選擇有氧糖酵解的代謝方式，并且其在腫瘤的生長過程中起著至關(guān)重要的作用[17～19]。PKM2是PKM前體RNA選擇性剪切的產(chǎn)物，有報道發(fā)現(xiàn)在PKM選擇性剪切的過程中，c-Myc介導的hnRNPs蛋白表達增加后下調(diào)PKM1的表達，上調(diào)PKM2的表達[20]。此外，mTOR通路可激活c-Myc和HIF-1α，進而上調(diào)PKM2的表達。本研究發(fā)現(xiàn)PKM2在結(jié)直腸癌組織中的表達量明顯高于正常結(jié)直腸黏膜組織，且PKM2的表達與結(jié)直腸癌的臨床分期、浸潤深度和淋巴轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)，顯示PKM2在結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展過程中起著重要作用。

有研究發(fā)現(xiàn)mTOR通路過度活化后產(chǎn)生低氧效應，上調(diào)HIF-1α的表達，HIF-1α通過介導的選擇性剪切使PKM2表達量上調(diào)，高水平的PKM2進一步介導Warburg效應的發(fā)生[21]。這一發(fā)現(xiàn)中的mTOR/HIF-1α/PKM2糖酵解級聯(lián)反應為腫瘤發(fā)生與發(fā)展所必需，目前認為mTOR信號通路的激活是多數(shù)腫瘤中發(fā)生Warburg效應的主要原因。

綜上所述，mTOR/HIF-1α/PKM2糖酵解級聯(lián)反應中的各個蛋白分子在結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展中具有重大意義，且相關(guān)性分析表明mTOR/HIF-1α/PKM2之間存在一定的交互關(guān)系，3種蛋白在結(jié)直腸癌細胞發(fā)生發(fā)展過程中互相聯(lián)系，并與其他相關(guān)的信號通路交織而促進腫瘤細胞生長、浸潤、侵襲及轉(zhuǎn)移。臨床檢測體液或病變組織中mTOR、HIF-1α、PKM2的表達量，對于結(jié)直腸癌早期發(fā)現(xiàn)、動態(tài)監(jiān)測、療效評價及預后評估具有重要臨床指導意義，并可作為結(jié)直腸癌治療的新的作用靶點。

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醫(yī)學論文中有關(guān)實驗動物描述的要求

在醫(yī)學論文的描述中，凡涉及到實驗動物者，在描述中應符合以下要求：(1)品種、品系描述清楚；(2)強調(diào)來源交待；(3)遺傳背景；(4)微生物學質(zhì)量；(5)明確體質(zhì)量；(6)明確等級；(7)明確飼養(yǎng)環(huán)境和實驗環(huán)境；(8)明確性別；(9)有無質(zhì)量合格證；(10)有對飼養(yǎng)的描述(如飼料類型、營養(yǎng)水平、照明方式、溫度要求、濕度要求)；(11)所有動物數(shù)量準確；(12)詳細描述動物的健康狀況；(13)對動物實驗的處理方式有單獨清楚的交代；(14)全部有對照，部分可采用雙因素方差分析。

Expression of mTOR, HIF-1α and PKM2 in human colorectal cancer tissues

LINPing,DENGTao,YEYan,WANGWeibo,LIUMiao,LUOHesheng.

DepartmentofGastroenterology,RenminHospitalofWuhanUniversity,Wuhan430060,China

DENGTao,E-mail:dengtao1120@hotmail.com

Objective To observe the expression of mammalian target of rapamycin observation of human colorectal cancer tissues (mTOR), hypoxia inducible factor 1 alpha (HIF-1α) and tyrosine kinase M2 (PKM2), and to explore its clinical significance.Methods 87 specimens of colorectal cancer after surgical operation and colonoscopic resection were enrolled as colorectal cancer group, 30 cases of normal colorectal tissues were enrolled as normal colorectal cancer group, the expression of immunohistochemistry method was used to detect the mTOR, HIF-1α, PKM2.Results The average optical density of mTOR, HIF1α and PKM2 in colorectal cancer group were significantly higher than that in normal colorectal cancer group (1 215.8±153.4 vs. 5 165.6±391.8, 1 633±115.6 vs. 4 474.4 ±255.9, 4 031.8±477.1 vs. 9 736±128.7, respectively,P<0.05).underdifferentgender,age,thedegreeofdifferentiation,mTOR,HIF-1αandPKM2expressionrateshowednosignificantdifference(P>0.05);theexpressionofdifferentDukesstagesandlymphnodemetastasisofmTOR,HIF-1αandPKM2wasstatisticallysignificant(P<0.05);underdifferentdegreeofinvolvement,expressionofmTORandPKM2wasstatisticallysignificantdifferent(P<0.05),andHIF-1αexpressionshowednosignificantdifference(P>0.05).MTORincolorectalcancerwaspositivecorrelatedwithHIF-1α,PKM2protein(R=0.247,R=0.512,P<0.05),andHIF-1αwaspositivelycorrelatedwithPKM2 (r=0.568,P<0.05).Conclusion The relative expression of mTOR, HIF-1α and the amount of PKM2 in human colorectal carcinoma was significantly higher than non-oncology population, and its expression is associated with colorectal cancer proliferation and metastasis, and can be used as targeted therapy for colorectal cancer action site.

Colorectal cancer; Tyrosine kinase; Target of rapamycin; Hypoxia inducible factor 1α;Immunohistochemistry

湖北省自然科學基金項目資助項目(No.2011CHB024)

430060 武漢大學人民醫(yī)院消化內(nèi)科/消化系統(tǒng)疾病湖北省重點實驗室

鄧濤，E-mail:dengtao1120@hotmail.com

2015-01-08)