胡哲夫，唐其柱，劉源，李金，張文斌

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論著·基礎(chǔ)

橙皮素對轉(zhuǎn)化生長因子-β1誘導(dǎo)心肌成纖維細(xì)胞增殖的影響

胡哲夫，唐其柱，劉源，李金，張文斌

目的 探討橙皮素(HES)對轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGF-β1)誘導(dǎo)心肌成纖維細(xì)胞增殖的影響，并探討其可能的機(jī)制。方法 取SD大鼠30只，取其心肌組織進(jìn)行成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)。而后采用TGF-β1(10ng/ml)刺激成纖維細(xì)胞，采用4種不同濃度梯度的HES(25μmol/L、50μmol/L、75μmol/L、100μmol/L)干預(yù)成纖維細(xì)胞24h，以臺盼藍(lán)染色檢測其對細(xì)胞活性的影響；熒光酶標(biāo)儀檢測法用于檢測細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)的水平；活細(xì)胞計數(shù)試劑盒(CCK-8)用以檢測成纖維細(xì)胞的增殖情況。結(jié)果 臺盼藍(lán)染色結(jié)果提示，HES對成纖維細(xì)胞的細(xì)胞活性無顯著影響，各組活性值分別為空白對照組：100%，HES25μmol/L組:95%，HES50μmol/L組：94%，HES75μmol/L組: 93%，HES100μmol/L組:93%。酶標(biāo)儀檢測結(jié)果表明，與空白對照組相比，TGF-β1可增加成纖維細(xì)胞內(nèi)ROS的水平(P<0.01)，當(dāng)HES與TGF-β1同時作用時，ROS水平隨著HES濃度的增加逐漸降低，均存在統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；TGF-β1可刺激成纖維細(xì)胞增殖(P<0.01)，當(dāng)HES(100μmol/L)或N-乙酰半胱氨酸(NAC)(1mmol/L)與TGF-β1同時作用時，可明顯抑制成纖維細(xì)胞增殖(P<0.01)。結(jié)論HES可通過抑制TGF-β1誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激進(jìn)而抑制心肌成纖維細(xì)胞增殖，提示其對于預(yù)防心肌纖維化可能具有潛在效果。

橙皮素；轉(zhuǎn)化生長因子-β1；成纖維細(xì)胞；細(xì)胞活性

【DOI】 10.3969 /j.issn.1671-6450.2015.04.014

在心肌肥厚及心肌纖維化的過程中，常伴有成纖維細(xì)胞的過度增殖和膠原分子的大量分泌，而纖維化的持續(xù)進(jìn)展會導(dǎo)致心肌收縮及舒張功能障礙，心律失常以及室壁順應(yīng)性降低，最終可導(dǎo)致心力衰竭[1～3]。既往研究表明[4～6]，轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGF-β1)具有促進(jìn)炎性反應(yīng)、氧化應(yīng)激、纖維化等作用，且TGF-β1可顯著促進(jìn)成纖維細(xì)胞的增殖及細(xì)胞外基質(zhì)的沉積。橙皮素(hesperotin,HES)是一種二氫黃酮類化合物，具有抗炎、抗氧化、抑制腫瘤生長、抗血小板聚集等多種生物學(xué)功效[7，8]，但其在心血管系統(tǒng)中研究尚少。因此本研究擬用TGF-β1刺激心肌成纖維細(xì)胞的增殖，并以HES干預(yù)，觀察HES是否對TGF-β1誘導(dǎo)的心肌成纖維細(xì)胞增殖產(chǎn)生影響，并探討其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與試劑 出生1～7 d的SPF級雄性SD大鼠30只,購自武漢大學(xué)動物實驗中心[動物合格證號:SCXK(鄂)2008-0004]，飼養(yǎng)于武漢大學(xué)人民醫(yī)院實驗動物中心SPF級動物室[使用許可證號：SYXK(鄂)2004-0027]。動物實驗的操作均參照美國《實驗動物管理和使用指南》， 且經(jīng)過武漢大學(xué)人民醫(yī)院動物管理和使用中心的批準(zhǔn)。試劑：橙皮素(上海融禾醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司)，DMEM/F12培養(yǎng)基(上海立菲生物技術(shù)有限公司)，新生小牛血清(NCS)、雙抗(青霉素+鏈霉素)、0.125%胰蛋白酶消化液(美國Gibco公司)，TGF-β1(美國PEPROTECH公司)，2′，7′-二氯熒光黃雙乙酸鹽(DCFH-DA)(美國Sigma公司)、CCK-8試劑盒(日本同仁化學(xué)研究所本)。

1.2 成纖維細(xì)胞的獲得及培養(yǎng) 取 SD大鼠以75%的乙醇浸泡數(shù)秒，對其頸部以下消毒， 抓取小鼠，固定四肢，由頸部沿左鎖骨中線剪開胸腔，暴露心臟后將心臟完整剪下，置于已在冰臺上預(yù)冷的含有 DMEM/F12培養(yǎng)基和20% NCS的培養(yǎng)皿中，清洗2次后，將組織剪成約1 mm3大小，轉(zhuǎn)移至含有轉(zhuǎn)子的培養(yǎng)瓶中，加入0.125%的胰酶，在37℃恒溫磁力攪拌器中消化10 min后將里面的胰酶吸出棄去(因第1次消化下來的有很多雜細(xì)胞)， 再次加入胰酶， 消化10 min后將胰酶吸出轉(zhuǎn)移至50 ml離心管內(nèi)， 同時向離心管中加入1.5倍體積的含有20%NCS的DMEM/F12 培養(yǎng)基終止消化。再向培養(yǎng)瓶中加入胰酶，重復(fù)操作3次，直到心臟組織變小變白。用50 ml離心管離心，棄去上清后重懸，將懸浮液使用40 μmol/L過濾網(wǎng)過濾后分裝至已經(jīng)采用0.1%明膠包被的培養(yǎng)皿中，差時貼壁1.5 h后移去培養(yǎng)皿中上清，重新加入新鮮培養(yǎng)基后繼續(xù)培養(yǎng)，24 h后再次換液。細(xì)胞培養(yǎng)在37℃恒溫、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱中，采用含有20%NCS和1% 雙抗(青霉素+鏈霉素)的DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞。使用對數(shù)生長期的細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到約80%后，使用0.125%的胰酶消化并以1∶2的比例傳代，每次傳代時細(xì)胞密度控制在1×105/ml。

1.3 細(xì)胞活性檢測 實驗分組：空白對照組，HES 25 μmol/L組，HES 50 μmol/L組，HES 75 μmol/L組，HES 100 μmol/L組。將細(xì)胞接種至6孔板中，采用不同的處理因素處理成纖維細(xì)胞24 h后，使用0.125%的胰酶消化細(xì)胞并小心吹打，使其成為單細(xì)胞懸液，分別吸取10 μl細(xì)胞與10 μl臺盼藍(lán)置于60 μl離心管混合后，再次吸取10 μl混合液放置在細(xì)胞計數(shù)儀檢測板上對其進(jìn)行檢測，計數(shù)儀自動讀取數(shù)據(jù)。將空白對照組設(shè)為參考值100%，其余組數(shù)值與之對比即得出相對細(xì)胞活性。本實驗重復(fù)3次，取平均值。

1.4 ROS的檢測 實驗分組:空白對照組，單加TGF-β1組(10 ng/ml)，TGF-β1(10 ng/ml)+ HES(25 μmol/L)組，TGF-β1(10 ng/ml)+HES(50 μmol/L)，TGF-β1(10 ng/ml)+HES(100 μmol/L)組。將細(xì)胞均勻接種至96孔板中，每孔100 μl，置于溫箱繼續(xù)培養(yǎng)24 h，細(xì)胞密度達(dá)到80%后將培養(yǎng)基更換為無血清的培養(yǎng)基饑餓24 h，然后采用不同處理因素干預(yù)24 h，將96孔板中的培養(yǎng)基換為含有10 μmol/L的DCFH/DA 的培養(yǎng)基繼續(xù)孵育20 min，之后將培養(yǎng)基吸出，用PBS清洗3次，以排除未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部的DCFH/DA的干擾。最后再次加入PBS 100 μl，置于酶標(biāo)儀下檢測，激發(fā)光波長為485 nm，發(fā)射光波長為525 nm。ROS 水平(%) =干預(yù)組熒光值/空白對照組熒光值×100%，將空白對照組設(shè)為參考值100%，其余組ROS水平與之對比即得出相對ROS水平。本實驗重復(fù)3次，取平均值。

1.5 細(xì)胞增殖能力測定 實驗分組:空白對照組，單加TGF-β1組(10 ng/ml)，TGF-β1(10 ng/ml)+ HES(100 μmol/L)組，TGF-β1(10 ng/ml)+ NAC(1 mmol/L)。將細(xì)胞均勻接種至96孔板中，每孔100 μl，置于溫箱培養(yǎng)24 h后將培養(yǎng)基更換為無血清的培養(yǎng)基饑餓24 h，采用不同處理因素干預(yù) 24 h后，將培養(yǎng)基換為含有10 μl CCK-8的無血清培養(yǎng)基100 μl，繼續(xù)在溫箱中孵育2.0～2.5 h后置于酶標(biāo)儀下檢測(波長450 nm)。轉(zhuǎn)化率=干預(yù)組細(xì)胞的增殖平均值/空白對照組細(xì)胞的增殖平均值將。將空白對照組設(shè)為參考值100%，其余組數(shù)值與之相對比即得出增殖相對比率。本實驗重復(fù)3次，取平均值。

2 結(jié) 果

2.1HES對細(xì)胞活性的影響 臺盼藍(lán)染色結(jié)果提示，4組不同濃度梯度的HES干預(yù)成纖維細(xì)胞24h后細(xì)胞活性分別為HES25μmol/L組:95%，HES50μmol/L組：94%，HES75μmol/L組: 93%，HES100μmol/L組:93%，與未加任何處理因素的空白對照組(100%)相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。見圖1。

圖1 HES對成纖維細(xì)胞活性的影響

2.2HES對ROS產(chǎn)生的抑制作用 與空白對照組相比，TGF-β1刺激成纖維細(xì)胞24h后可顯著增加細(xì)胞中ROS的產(chǎn)生(P<0.01)；當(dāng)TGF-β1與HES同時處理時，可呈濃度依賴性地抑制ROS的產(chǎn)生(P<0.05)。見圖2。

圖2 HES可抑制ROS的產(chǎn)生

注：與空白對照組比較，aP<0.05；與TGF-β1組比較，bP<0.05

2.3HES對TGF-β1誘導(dǎo)細(xì)胞增殖的抑制作用 與空白對照組相比，TGF-β1可顯著刺激成纖維細(xì)胞的增殖(P<0.01)；而TGF-β1與HES(100μmol/L)同時使用時，與TGF-β1組相比，則可顯著抑制細(xì)胞增殖(P=0.017)；TGF-β1與NAC(1μmol/L)同時使用時，同樣可以抑制細(xì)胞增殖(P<0.01)。見圖3。

3 討 論

本研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β1可誘導(dǎo)心肌成纖維細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷，增加胞內(nèi)ROS的水平。而不同濃度的HES與TGF-β1同時作用于成纖維細(xì)胞后，胞內(nèi)ROS含量明顯低于TGF-β1組(P<0.05)，且呈現(xiàn)濃度依賴性，即隨著HES藥物濃度的增加，對ROS的抑制作用逐漸增強(qiáng)。本研究還發(fā)現(xiàn)TGF-β1能夠刺激成纖維細(xì)胞的增殖，而HES與TGF-β1同時作用時可顯著逆轉(zhuǎn)這種現(xiàn)象；NAC作為一種ROS活性抑制劑，同樣能夠抑制TGF-β1誘導(dǎo)的成纖維細(xì)胞增殖[4]。因此，推斷HES通過抑制心肌組織成纖維細(xì)胞的氧化應(yīng)激來抑制細(xì)胞增殖。

圖3 HES對TGF-β1誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞增殖的抑制作用

注：與空白對照組比較，aP<0.05；與TGF-β1組比較，bP<0.05

心肌纖維化是一種常見的心血管系統(tǒng)并發(fā)癥，常發(fā)生于各種心肌病中[9]。纖維化的持續(xù)發(fā)展會弱化左室收縮及舒張功能，進(jìn)而引起射血分?jǐn)?shù)降低，左心功能不全，甚至?xí)?dǎo)致終末期心功能衰竭[10，11]。而成纖維細(xì)胞的增殖與心肌纖維化的發(fā)展密切相關(guān)，因此控制其增殖對于有效地提高心功能至關(guān)重要。

HES作為蕓香科柑橘屬植物的主要成分之一，具有抗炎、抗氧化、抗癌及抗微生物等多種生理作用[7，8]。在心血管系統(tǒng)中，HES還具有降脂、抗血小板聚集、舒張血管等功效，從而維持心血管系統(tǒng)的正常生理功能[7，12]。

研究表明[13]，氧化/抗氧化失衡是引起機(jī)體內(nèi)氧化應(yīng)激損傷的重要原因。大量產(chǎn)生的ROS如過氧化氫(H2O2)、超氧陰離子(·O2-)、羥自由基(·OH)等都可與體內(nèi)大分子物質(zhì)如核酸及蛋白質(zhì)分子反應(yīng)，破壞細(xì)胞或組織的正常結(jié)構(gòu)及功能從而引起損傷[13，14]。既往大量實驗證實[1,3,15]，TGF-β1可通過促炎、促氧化應(yīng)激等途徑引起多個組織器官中ROS的活化及成纖維細(xì)胞的增殖，如肺臟、腎小管上皮、心肌組織等。這些學(xué)者均認(rèn)為，ROS是直接促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖的重要因子，并且ROS可通過多種途徑來刺激成纖維細(xì)胞的增殖并分泌膠原分子進(jìn)一步促進(jìn)組織器官的纖維化。因此控制成纖維細(xì)胞中ROS的水平對于其增殖能力十分關(guān)鍵。許多研究者認(rèn)為，ROS在機(jī)體內(nèi)是一把雙刃劍，在正常生理條件下，機(jī)體內(nèi)ROS的產(chǎn)生和降解處于一種動態(tài)平衡，一旦受到促炎因子刺激，ROS的清除能力減弱，進(jìn)一步引起內(nèi)皮細(xì)胞的炎性損傷及功能障礙。少量的ROS作為胞內(nèi)的重要信使分子起到了一定的積極作用，但過量的ROS可介導(dǎo)炎性反應(yīng)或氧化應(yīng)激，引起血管內(nèi)皮的損傷從而引起心血管系統(tǒng)疾病。Liu等[4]認(rèn)為，TGF-β1可刺激機(jī)體多個組織器官產(chǎn)生ROS，而ROS能夠進(jìn)一步反饋性活化TGF-β1，從而進(jìn)一步刺激成纖維細(xì)胞的增殖和細(xì)胞外基質(zhì)的沉積。該研究表明[4]，在成纖維細(xì)胞中，TGF-β1不僅可通過活化胞中的NOX4分子并刺激線粒體及微粒體中H2O2的表達(dá)，還可激活下游的Smad2或Smad3分子進(jìn)而促進(jìn)心肌組織發(fā)生上皮向間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)，使成纖維細(xì)胞大量增殖并遷移；另一方面，TGF-β1增加心肌組織中產(chǎn)生大量的ROS，并降低谷胱甘肽、過氧化物酶、谷氧化蛋白等抗氧化物的水平，降低心肌組織抗氧化損傷的能力；此外，大量的ROS可激活MAPK信號通路，使pERK、p38、pJNK等大量表達(dá)，引起各種促肥厚及促纖維化分子表達(dá)增加，有利于成纖維細(xì)胞的增殖而進(jìn)一步引起心肌纖維化。

本結(jié)果表明，TGF-β1可提高心肌組織內(nèi)成纖維細(xì)胞中ROS的水平并誘導(dǎo)細(xì)胞增殖，當(dāng)HES與TGF-β1同時作用時可逆轉(zhuǎn)以上現(xiàn)象。說明HES可抑制TGF-β1誘導(dǎo)的心肌成纖維細(xì)胞氧化應(yīng)激，從而抑制細(xì)胞增殖。證實了HES可通過直接抑制心肌成纖維細(xì)胞中ROS的產(chǎn)生從而發(fā)揮抗心肌成纖維細(xì)胞增殖的作用，從而可有效地抑制心肌纖維化的發(fā)生發(fā)展，這為HES將來的臨床應(yīng)用提供了一定的基礎(chǔ)實驗依據(jù)。但本次實驗局限于細(xì)胞水平，未研究動物在體實驗，心肌纖維化的其他標(biāo)記物也尚未檢測，因此存在一定的局限性，HES具體的分子機(jī)制仍需要進(jìn)一步闡明。

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Effect of hesperetin on cardiac fibroblast proliferarion induced by TGF-β1

HUZhefu,TANGQizhu,LIUYuan,LIJin,ZHANGWenbin.

DepartmentofCardiology,RenminHospitalofWuhanUniversity,HubeiProvince,Wuhan430060,China

TANGQizhu,E-mail:qztang@whu.edu.cn

Objective To investigate the effect of hesperetin (HES) on transforming growth factor-β1(TGF-β1) cardiac fibroblasts induced cell proliferation, and to explore its possible mechanism.Methods 30 SD rats were included; take the myocardial tissues to culture the fibroblasts. And then uses the TGF-β1(10 ng/ml) to stimulate fibroblast cells, with 4 different concentrations of HES (25 μmol/L, 50 μmol/L, 75 μmol/L, 100 μmol/L) to intervene fibroblasts for 24 h, blue staining was used to detect the effect on cell viability by trypan; enzyme-linked fluorescent immunoassay testing method was used for the detection of intracellular reactive oxygen species (ROS) level; living cell counting Kit (CCK-8) was used to detect the proliferation of fibroblasts. Results Trypan blue staining results indicated that, HES had no significant effect on fibroblast activity in cells, each activity values were blank control group:100%，HES 25 μmol/L group: 95%，HES 50 μmol/L group: 94%，HES 75 μmol/L group: 93%，HES 100 μmol/L group: 93%，enzyme mark instrument results show that, compared with the blank control group, TGF-β1can increase the level of ROS in fibroblast cells (P<0.01),whenHESandTGF-β1haveeffectatthesametime,ROSlevelsdecreasedgraduallywiththeincreaseofHESconcentration,therewerestatisticalsignificance(P<0.05);TGF-β1couldstimulatetheproliferationoffibroblasts(P<0.01),whenHES(100μmol/L)orN-acetylcysteine(NAC) (1mmol/L)andTGF-β1haveeffectatthesametime,theycaninhibitfibroblastproliferation(P<0.01).Conclusion Through inhibiting TGF-β1induced oxidative stress, HES can inhibit the proliferation of cardiac fibroblasts, which suggested that it may have potential for the prevention of myocardial fibrosis.

Hesperetin; Transforming growth factor β1;Fibroblasts; Cell activity

中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項基金資助項目(No.2012302020212)

430060 武漢大學(xué)人民醫(yī)院心血管內(nèi)科

唐其柱，E-mail:qztang@whu.edu.cn

2015-01-04)