徐俊麗，易福凌，劉永國(guó)，張明麗，吳松笛

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論著·臨床

CYP2C19基因多態(tài)性與幽門螺桿菌陽性老年胃癌 患者的關(guān)系研究

徐俊麗，易福凌，劉永國(guó)，張明麗，吳松笛

目的 研究CYP2C19基因多態(tài)性與幽門螺桿菌(HP)陽性老年胃癌患者的關(guān)系，探討遺傳因素在胃癌發(fā)病中的作用。方法 年齡>70歲的老年HP陽性患者150例，按照是否患有胃癌分為2組，HP陽性胃癌患者75例為觀察組，HP陽性的非胃癌患者(包括胃潰瘍、慢性胃炎等)75例為對(duì)照組，采用MassArraySNP方法檢測(cè)2組CYP2C19 基因分型。結(jié)果 觀察組患者CYP2C19基因分子為純合子快代謝型、雜合子快代謝以及慢代謝型，三者發(fā)生率分別為33.3%、40.0%、26.7%；對(duì)照組以上3種類型分別為40.0%、45.3%、14.7%，觀察組患者慢代謝型發(fā)生率較對(duì)照組高(χ2=9.284，P<0.05)。結(jié)論CYP2C19 的慢代謝型增加了老年HP陽性患者患胃癌的風(fēng)險(xiǎn)性，需要加強(qiáng)定期隨訪。

胃癌；細(xì)胞色素P450酶；CYP2C19；基因多態(tài)性

【DOI】 10.3969 /j.issn.1671-6450.2015.04.008

胃癌為我國(guó)常見的惡性腫瘤之一，在我國(guó)發(fā)病率居各類腫瘤的首位，胃癌的發(fā)生與許多遺傳因子均相關(guān)，且包括腫瘤壞死因子(TNF-α)、白介素-1(IL-1)、白介素-6(IL-6)等。CYP2C19 是細(xì)胞色素P450酶的一種亞型，遺傳學(xué)的改變使CYP450酶表現(xiàn)出遺傳多態(tài)性，并且具有明顯個(gè)體、種族或地域差異，從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)或酶的功能發(fā)生改變。CYP2C19 在前致癌物變成活化的致癌物方面發(fā)揮重要的作用，此外可能誘導(dǎo)環(huán)境致癌物的遺傳易感性，但是具體的作用機(jī)制仍不明確[1，2]。已有研究表明CYP2C19基因多態(tài)性與食管癌、肝癌、膀胱癌、乳腺癌、前列腺癌、結(jié)腸癌及白血病等多種腫瘤發(fā)生相關(guān)[3～7]。現(xiàn)探討CYP2C19基因多態(tài)性與幽門螺桿菌(HP)陽性的老年胃癌患者的關(guān)系，為明確胃癌的病因以及預(yù)防提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2013年5月—2014年3月在我院住院確診為HP陽性的原發(fā)性胃癌患者75例為研究組，男40例，女35例，年齡70～75(72.0±3.0)歲，腫瘤部位分別位于賁門、胃底以及胃體，基礎(chǔ)性疾病包括高血壓、冠心病、腦梗死等。HP陽性的非腫瘤患者(胃潰瘍、慢性胃炎)75例為對(duì)照組，其中男40例，女35例，年齡69～73(71.0±2.9)歲。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者及家屬同意并簽署知情同意書。

1.2 觀測(cè)方法 清晨空腹抽取患者外周血2 ml，EDTA抗凝，-80℃保存。

1.2.1 引物設(shè)計(jì)： 根據(jù)基因的目標(biāo)序列和選擇的多態(tài)性位點(diǎn)，使用Sequenom Mass ARRAY Assay Design 3.0 軟件(美國(guó)西格諾公司 )設(shè)計(jì)多重PCR特異性引物和單堿基延伸引物。對(duì)于rs4244285 位點(diǎn)(CYP2C19*2)，特異性擴(kuò)增引物5’-ACGTTGGATGACTTTCTCCAAAATATCTG-3’，5’-ACGTTGGATGGCAATAATTTTCCCACTTT-3’，延伸引物 AGTAATTTGTTATGGGTT。對(duì)于rs4986893 位點(diǎn)(CYP2C19*3)， 特異性擴(kuò)增引物 5’-ACGTTGGATGGACTGTAAGTGGTTTCTCG-3’， 5’-ACGTTGGATGAACATCAGGATTGTAAGG-3’，延伸引物為 TGGCCTTACCTGG。

1.2.2 CYP2C19基因型檢測(cè)步驟：

1.2.2.1 PCR擴(kuò)增反應(yīng) 將384孔 PCR 板放在 384 孔冰板上，1個(gè)500 μl 離心管放在冰板上，-20℃取出融化，輕微震蕩離心，混旋均勻后短暫離心，每孔 4 μl PCR Mix 加入 384 孔 PCR 板中，然后加入 1 μl 的 DNA 樣品。膜封閉平板，混旋均勻后，常溫4 000 r/min 離心 2 min。將 384 孔 PCR 板放入 PCR 儀中，進(jìn)行 PCR 循環(huán)：用時(shí)約 140 min。95℃ 2 min ；45 個(gè)循環(huán)：95℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 60 s，72℃ 5 min，4 ℃保存。

1.2.2.2 蝦堿性磷酸酶(SAP)純化 PCR 儀中取出樣品平板，常溫，4 000 r/min，離心 2 min，放置 384 孔冰板上。配置各種試劑，-20℃取出融化(酶使用前再?gòu)?20℃中取出，勿震蕩)，輕微震蕩離心備用。配制 SAP Mix，混旋均勻，離心后將 SAP 混合液加入到 PCR 反應(yīng)體系中，每孔加入2 μl 混合液，使總體系達(dá)到7 μl。用封口膜封閉，渦旋混勻、常溫4 000 r/min離心 2 min。按照以下條件進(jìn)行 SAP 反應(yīng)，用時(shí)約 50 min： 37℃ 40 min，85℃ 5 min，4℃循環(huán)。

1.2.2.3 單堿基延伸反應(yīng) 從 PCR 儀中取出樣品平板，常溫，4 000 r/min，離心 2 min，放置 384 孔冰板上備用。-20℃取出融化后，輕微震蕩離心備用?；煨鶆?，離心后將 UEP Mix 分裝至新的 384 孔反應(yīng)板中，每孔加入2 μl，使總體系達(dá)到9 μl。用封口膜封閉，混旋均勻，常溫4 000 r/min 離心2 min。進(jìn)行單堿基延伸反應(yīng)，用時(shí)約 240 min。

1.2.2.4 樹脂交換 將樹脂倒在平板上，對(duì)應(yīng)相應(yīng)進(jìn)行反應(yīng)的孔，用玻璃平板反復(fù)推拉壓實(shí)， 去除并回收多余樹脂，干燥 10 min。從 PCR 儀中取出樣品平板，常溫，4 000 r/min，離心 2 min，放置于室溫。在樣品平板上進(jìn)行反應(yīng)的孔中加入16 μl 的純凈水，混旋均勻，4 000 r/min 離心 5 min。小心將樣品平板倒扣在樹脂板上，壓緊并反轉(zhuǎn)，輕敲樹脂平板，讓樹脂全部落入樣品平板中。用封口膜封閉樣品平板，在靜音混懸器上混懸 15 min。在離心機(jī)上4 000 r/min 離心 5 min。

1.2.2.5 質(zhì)譜檢測(cè) 準(zhǔn)備好的樣本板放入 MassArray 點(diǎn)樣儀，進(jìn)行點(diǎn)樣。將點(diǎn)好樣本的芯片放入 MassArray 質(zhì)譜儀，進(jìn)行質(zhì)譜檢測(cè)。在數(shù)據(jù)服務(wù)器上通過 Typer 4.0 軟件進(jìn)行分析

2 結(jié) 果

2.1 基因分型CYP2C19*2基因分3型，分別為CYP2C19*1/*1 (野生型2*GG)、CYP2C19*1/*2 (純合突變2*GA)、CYP2C19*2/*2(雜合突變2*AA)；CYP2C19*3基因分3型，分別為CYP2C19*1/*1 (野生型3*GG)、CYP2C19*1/*3 (純合突變3*GA)、CYP2C19*3/3(雜合突變3*AA)。2個(gè)位點(diǎn)的基因結(jié)果均為GG，則為純合子快代謝；GG+GA、GG+AA、GA+GA為雜合子快代謝型，GA+AA或AA+AA為慢代謝。各基因型特征性質(zhì)譜圖見圖1～5(因CYP2C19*3AA基因型較少，本文未繪制其質(zhì)譜圖)。

圖1 CYP2C19*2的AA基因型典型質(zhì)譜圖

2.2 基因型構(gòu)成 觀察組患者CYP2C19分為純合子快代謝型、雜合子快代謝型及慢代謝型，三者發(fā)生率分別為33.3%、40.0%、26.7%，對(duì)照組分別為40.0%、45.3%、14.7%，觀察組患者的慢代謝型發(fā)生率明顯較對(duì)照組高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=9.284，P<0.05)。

圖2 CYP2C19*2的GG基因型典型質(zhì)譜圖

圖3 CYP2C19*2的GA基因型典型質(zhì)譜圖

圖4 CYP2C19*3的GG基因型典型質(zhì)譜圖

圖5 CYP2C19*3的GA基因型典型質(zhì)譜圖

3 討 論

亞洲地區(qū)胃癌發(fā)病率比較高，純合子快代謝型、雜合子快代謝型以及慢代謝型這3種基因型在亞洲國(guó)家的分布頻率分別為30%～40%，40%～50%和14%～22%，而在歐美等國(guó)家則分別為70%～75%，20%～25%以及2%～5%[8～10]。這些數(shù)據(jù)表明慢代謝型基因有可能會(huì)促進(jìn)胃癌的發(fā)生，與本結(jié)果一致，可能CYP2C19的慢代謝型與胃癌的發(fā)生密切相關(guān)。

胃癌的病因迄今尚未完全闡明，大量研究資料表明胃癌的發(fā)生是多種因素綜合作用的結(jié)果，外界因素包括胃通過飲食與外界接觸，某些致癌因素可發(fā)揮致癌作用。如N-亞硝基化合物以及幽門螺桿菌感染等，此外真菌、毒素可以誘發(fā)大鼠胃腺癌或胃的癌前病變。國(guó)內(nèi)外許多研究表明幽門螺桿菌感染與胃癌的發(fā)生密切相關(guān)，根除幽門螺桿菌后胃癌的發(fā)病率明顯下降[11]，因此對(duì)于具有胃癌高危因素的慢代謝型的HP陽性患者，應(yīng)該進(jìn)行正規(guī)的除菌治療。

目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于CYP2C19與腫瘤的關(guān)系研究較多，發(fā)現(xiàn)CYP2C19的慢代謝者在不同腫瘤的發(fā)生率不同。目前認(rèn)為其主要機(jī)制有：CYP2C19參與前致癌物的活化，主要代表為膀胱癌，CYP2C19參與了致癌物質(zhì)的滅活；慢代謝者與食管癌、肺癌以及胃癌的發(fā)生具有相關(guān)性，推測(cè)當(dāng)CYP2C19酶活性減弱時(shí)，這些致癌物在體內(nèi)代謝減慢，導(dǎo)致其在體內(nèi)堆積，增加了致癌物在體內(nèi)的濃度以及作用時(shí)間，從而增加了腫瘤的易感性[12～14]。日本有學(xué)者對(duì)幽門螺桿菌感染者進(jìn)行調(diào)查，發(fā)現(xiàn)慢代謝者患胃癌的風(fēng)險(xiǎn)性較高[15]。目前國(guó)內(nèi)對(duì)于老年HP陽性胃癌患者的基因檢測(cè)相對(duì)較少，本次研究結(jié)果提示CYP2C19 的慢代謝型增加了老年HP陽性患者患胃癌的風(fēng)險(xiǎn)性，可能與其參與了致癌物的滅活相關(guān)，具體與哪些致癌物滅活相關(guān)，需要進(jìn)一步的研究。對(duì)于此類HP陽性患者我們需要加強(qiáng)定期隨訪以減少發(fā)病率及病死率。

總之，本次研究探討了CYP2C19的基因分型與老年胃癌發(fā)病的關(guān)系，但因樣本量有限，結(jié)果仍有其局限性，對(duì)HP陰性的胃癌患者未進(jìn)行檢測(cè)，需要在今后的研究中進(jìn)一步證實(shí)。

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Relationship between the CYP2C19 gene polymorphism and gastric cancer in old patients with helicobacter pylori infection

XUJunli*,YIFuling,LIUYongguo,ZHANGMingli,WUSongdi.

*DepartmentofGeriatrics,Xi’anFirstHospital,ShanxiProvince,Xi’an710002,China

Objective To investigate the relationship between CYP2C19 gene polymorphism and helicobacter pylori (HP) positive elderly patients with gastric cancer, also investigate the effect of genetic factors in the pathogenesis of the di-sease.Methods 150 cases of aged >70 years old HP positive patients were enrolled, according to whether suffered from gastric cancer, they were divided into 2 groups, HP positive gastric cancer patients of 75 cases as the observation group, HP positive without gastric cancer patients (including gastric ulcer, chronic gastritis) of 75 cases as control group, using the MassArray SNP method to detect the CYP2C19 genotyping of the 2 groups.Results Observation groups’ CYP2C19 gene type were homozygous with fast metabolism, heterozygous fast metabolism and slow metabolism, the incidence were 33.3%, 40.0%, 26.7% respectively; the control group’s incidence were 40.0%, 45.3%, 14.7% respectively, the incidence of slow metabolic type in the observation group was higher than the control group (χ2=9.284,P<0.05).Conclusion CYP2C19’s slow metabolism type increases the risk of gastric cancer in elderly patients with positive HP, regular follow-up should be strengthen.

Gastric cancer; Cytochrome P450 enzyme;CYP2C19；Gene plymorphism

陜西省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.2013JC2-14)； 西安市衛(wèi)生局科研基金項(xiàng)目(No.2013-07)

710002 西安市第一醫(yī)院老年病科消化腫瘤病區(qū)(徐俊麗、劉永國(guó)、張明麗、吳松笛)，檢驗(yàn)科(易福凌)

2014-12-24)