晏建新　王曉麗

[摘要] 目的 優(yōu)化金櫻子中鞣質(zhì)的超聲提取工藝。 方法 采用磷鉬鎢酸-紫外分光光度法測定鞣質(zhì)含量，在單因素試驗的基礎(chǔ)上，選取液料比、超聲提取時間和乙醇百分濃度作為自變量，金櫻子鞣質(zhì)提取率為因變量，對自變量各水平進(jìn)行多元線性回歸和二項式擬合，采用星點設(shè)計-響應(yīng)面法選擇最佳工藝條件，并進(jìn)行預(yù)測分析。 結(jié)果 最佳工藝為：乙醇濃度75%，料液比1∶30，超聲提取時間60 min，提取溫度為50℃。 結(jié)論 優(yōu)化的金櫻子中鞣質(zhì)超聲波提取工藝簡便可靠、穩(wěn)定、提取率高，為金櫻子中鞣質(zhì)的開發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。

[關(guān)鍵詞] 金櫻子；鞣質(zhì)；超聲提?。豁憫?yīng)面法

[中圖分類號] R284.2 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-7210（2015）02（b）-0099-04

[Abstract] Objective To optimize the process of ultrasonic extracting effective constituents from Rosa Laevigatae Fructus of tannin. Methods The content of tannin was determined by phosphomolybdotungsitc acid-UV spectmphotometry solvent. Based on single-factor tests， with ethanol percent， solid-liquid ratio， extraction time as independent variables and yield of tannin from Rosa Laevigatae Fructus as dependent variable， multiple linear regression and binomial fitting was adopted by central composite design model， and determine optimum extraction technology， and the forcast analysis was done. Results The best extraction process was as followed： the concentration ethanol of 75%， ratio of solid-liquid of 1∶30， extraction time of 60 min， extraction temperature of 50℃. Conclusion This optimized extraction process is simple and reliable， it can laid a certain foundation for development and utilization of tannins from Rosa Laevigatae Fructus.

[Key words] Rosa Laevigatae Fructus； Tannin； Ultrasonic extraction； Response surface method

金櫻子是薔薇科植物金櫻子（Rosa laevigata Michx.）的干燥成熟果實[1]，又名蜂糖罐，在我國大多數(shù)地方均有分布，特別是貴州省分布廣，產(chǎn)量高[2]。金櫻子藥食同源[3]，具有補腎固精、止瀉之功效?；瘜W(xué)成分研究多為多糖類和黃酮類，對鞣質(zhì)類研究較少。鞣質(zhì)具有收斂性，內(nèi)服可治胃腸道出血、水瀉等癥，被認(rèn)為是良好的天然抗氧化劑[4]。鞣質(zhì)是一類次生代謝產(chǎn)物，植物界廣泛存在，近幾年的研究表明鞣質(zhì)具有較好的抗腫瘤活性[5]。

星點設(shè)計是在二水平析因設(shè)計的基礎(chǔ)上，加中心點和星點組成，實驗次數(shù)較少，對非線性擬合的實驗設(shè)計較適宜，具有實驗設(shè)計簡單、試驗次數(shù)少、精密度高的特點[6]。響應(yīng)面法集數(shù)學(xué)和統(tǒng)計學(xué)方法于一體，是建模和多元變量最優(yōu)化的一種統(tǒng)計方法[7]。對于中藥有效成分的提取工藝研究，星點設(shè)計以及效應(yīng)面優(yōu)化法是重要的實驗條件設(shè)計、優(yōu)化方法之一，具有數(shù)據(jù)量大、預(yù)測性好、直觀的優(yōu)點，比正交和均勻設(shè)計更適用于探索性的試驗研究。因此采用此方法研究金櫻子中鞣質(zhì)的超聲提取工藝，為金櫻子的合理開發(fā)利用提供一定的科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與試藥

超聲清洗儀（上海超聲設(shè)備有限公司，SK3300H型）；紫外分光光度計（津島UV-2401型，日本）；分析天平（FA2004，上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司）；HH-2恒溫數(shù)顯水浴鍋（金壇市富華儀器有限公司）；FZ102型粉碎機(jī)（天津市泰斯特儀器公司）。

沒食子酸（中國藥品生物制品檢定所，批號為：110831-200302），其他所有試劑均為分析純；水為重蒸水。按《中國藥典》2010年版制訂的方法配制磷鉬鎢酸試液。

金櫻子，2013年10月采自貴州遵義縣團(tuán)溪鎮(zhèn)，經(jīng)貴陽醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院王曉麗教授鑒定為薔薇科植物金櫻子的成熟果實。

2 方法與結(jié)果

2.1 鞣質(zhì)的含量測定

2.1.1 對照品溶液的制備 精密稱取沒食子酸對照品25 mg，置于100 mL棕色量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，精密量取10 mL，置50 mL棕色量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻即得0.05 mg/mL沒食子酸溶液。

2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密量取對照品沒食子酸溶液0.5、1.0、2.0、4.0、5.0 mL分別置于25 mL棕色量瓶中，分別加磷鉬鎢酸溶液1 mL，再分別加水11.5、11、9、8、7 mL，搖勻，用20%碳酸鈉溶液稀釋至刻度[8]，搖勻，放置30 min，以相應(yīng)的試劑作空白實驗，照紫外-可見分光光度法，在波長為760 nm處測定，以濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。其線性方程為Y = 0.0609X-0.0056（r = 0.9997），表明沒食子酸在0.001～0.011 mg/mL與吸光度呈良好線性關(guān)系。

2.1.3供試品溶液的制備 金櫻子去刺、去核毛，置60℃恒溫箱中烘干，自然冷卻后粉碎（過60目篩），精密稱取粉末1 g，置250 mL棕色量瓶中，按照實驗設(shè)計，分別精密加入不同百分濃度、不同體積的乙醇，密塞，稱定其質(zhì)量；超聲波處理不同時間（超聲功率100 W，控制水溫在50℃以下[9-10]）后，取出稱其質(zhì)量，用相應(yīng)濃度乙醇補足失掉的質(zhì)量，搖勻，靜置后濾過，精密量取續(xù)濾液5 mL，在25℃條件下，減壓回收至不含乙醇為止，轉(zhuǎn)移至25 mL棕色量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，靜置后過濾，續(xù)濾液即供試品溶液[11]。

2.2 樣品測定

鞣質(zhì)含量測定[12]按照《中國藥典》2010年版一部附錄ⅩB進(jìn)行[1]。

2.2.1 總多酚含量的測定 精密量取供試品溶液2 mL，置25 mL棕色容量瓶中，加入磷鉬鎢酸試液1 mL，加水10 mL，按“2.1.2”項下“然后用20%碳酸鈉溶液稀釋至刻度”起，測定其吸光度，利用線性方程計算供試品溶液總多酚含量。

2.2.2 不被吸附的多酚含量的測定 精密稱取干酪素0.6 g于100 mL具塞錐形瓶中，精密量取供試品溶液25 mL加入錐形瓶中，密塞，置于30℃的水浴中保溫1 h，期間時時搖動，取出放冷，搖勻，過濾取續(xù)濾液2 mL置25 mL棕色量瓶中，按“2.1.2”項下下“然后用20%碳酸鈉溶液稀釋至刻度”起測定吸光度；同時空白實驗，不被吸附多酚的吸光度=供試品溶液中多酚的吸光度-空白溶液的吸光度，利用線性方程計算供試品溶液不被吸附的多酚含量。

2.2.3鞣質(zhì)含量的計算 鞣質(zhì)的含量=總多酚含量-不被吸附多酚含量，鞣質(zhì)是可被干酪素吸附的多酚；鞣質(zhì)提取率（%）=提取出的鞣質(zhì)含量/藥材中鞣質(zhì)的含量×100%。

2.3 單因素試驗考察

2.3.1 乙醇百分濃度 稱取干燥的金櫻子粉末約1.0 g，共5份，精密稱定，分別加入40%、50%、60%、70%、80%的乙醇30 mL于100 mL容量瓶中，超聲時間為60 min后，按“2.2”項下來計算鞣質(zhì)提取率分別為5.16%、5.57%、5.98%、5.97%、5.96%，故選取乙醇濃度70%。

2.3.2液料比 稱取干燥的金櫻子粉末約1.0 g，共5份，精密稱定，分別加入40%的乙醇10、20、30、40、50 mL于100 mL容量瓶中，超聲時間為60 min，按“2.2”項下計算鞣質(zhì)提取率分別為4.29%、5.31%、5.76%、5.56%、5.58%，故選取液料比30∶1。

2.3.3 超聲提取時間 稱取下干燥的金櫻子粉末約1.0 g，共5份，精密稱定，加入50%的乙醇30倍量于100 mL容量瓶中，分別超聲提取30、40、50、60、70 min，按“2.2”項下計算鞣質(zhì)提取率分別為4.22%、5.41%、5.58%、5.81%、5.67%，故選取提取時間60 min。

2.3.4 超聲提取溫度 稱取下干燥的金櫻子粉末約1.0 g，共5份，精密稱定，加入70%的乙醇30倍量于100 mL容量瓶中超聲提取60 min，分別在提取溫度30、40、50、60、70℃，按“2.2”項下計算鞣質(zhì)提取率分別為4.22%、5.31%、5.45%、4.35%、3.67%，故選取超聲提取溫度為50℃。溫度高于50℃時，鞣質(zhì)易發(fā)生變質(zhì)[9]，故采用冷凝水控制超聲溫度在50℃左右[10]。

2.4響應(yīng)面法優(yōu)選

以單因素試驗為基礎(chǔ)，上述4個自變量對金櫻子中鞣質(zhì)提取效果的影響程度較大的有乙醇百分濃度、超聲提取時間、液料比，因提取溫度的溫度范圍較小，所以對鞣質(zhì)提取率影響亦較小，所以通過CCD法對鞣質(zhì)提取率影響較大的超聲提取時間、乙醇百分濃度及液料比3個因素進(jìn)行優(yōu)選，以鞣質(zhì)提取率為因變量，設(shè)計了分別用代碼-α，-1、0、1、α（α =1.732）表示的三變量五水平實驗，變量水平見表1。

2.5 驗證實驗

驗證響應(yīng)曲面法所得到的最優(yōu)條件，檢驗得到的結(jié)果是否可靠，在最佳條件下分別提取了3次（考慮到實際操作的情況，將鞣質(zhì)最佳提取條件修正為料液比1∶30、超聲時間為60 min、乙醇濃度為75%），提取溫度為50℃，結(jié)果金櫻子鞣質(zhì)平均提取率為6.10%，與預(yù)測值的偏差0.94%，偏差不大吻合較好，說明優(yōu)選的提取超聲工藝預(yù)測性良好。

3 討論

3.1 提取方法的選擇

超聲提取現(xiàn)已應(yīng)用于大部分植物化學(xué)成分的提取[13]，利用超聲輻射產(chǎn)生的強(qiáng)烈擾動效應(yīng)、空化效應(yīng)等多種效應(yīng)來增加物質(zhì)分子運動速度、頻率、溶劑的穿透力以及加速提取成分進(jìn)入溶劑，這樣就能避免高溫對提取成分造成的影響。鞣質(zhì)為結(jié)構(gòu)復(fù)雜的多酚類化合物[14]，是一類熱不穩(wěn)定成分。因此本實驗采用超聲波提取金櫻子中鞣質(zhì)，節(jié)能省時，且能有效地提高金櫻子鞣質(zhì)的提取率。

3.2單因素的考察

通過單因素與星點設(shè)計-響應(yīng)面法相結(jié)合的試驗方法，對金櫻子中總鞣質(zhì)的提取工藝進(jìn)行了優(yōu)選。因響應(yīng)面優(yōu)化的前提是所設(shè)計的實驗點應(yīng)包括較佳的實驗條件，一旦實驗點選取不當(dāng)，就不能得到較好的優(yōu)選結(jié)果。因此本實驗在進(jìn)行星點設(shè)計之前，對可能影響金櫻子中鞣質(zhì)提取率的各因素分別進(jìn)行考察，確定了各個因素的較佳水平，并縮小了各因素的水平范圍，這對于通過效應(yīng)面法優(yōu)選較佳提取工藝有利，也有利于預(yù)測結(jié)果的準(zhǔn)確性。

基于Design-Expert 7.0.0試驗設(shè)計軟件，通過二次回歸得到了金櫻子鞣質(zhì)提取率與乙醇百分濃度、液料比、超聲提取時間的二次回歸模型，經(jīng)方差分析得出該回歸模型是合理可靠的，能較好地預(yù)測金櫻子鞣質(zhì)提取率。再利用該模型的響應(yīng)面及其等高線直觀得出對影響金櫻子鞣質(zhì)提取率較大因素的相互作用，得到最優(yōu)工藝為：乙醇百分濃度為75%，超聲提取時間為60 min，液料比為1∶30，超聲提取溫度為50℃。因此，利用星點設(shè)計-響應(yīng)曲面法對金櫻子鞣質(zhì)超聲提取工藝進(jìn)行優(yōu)選，能獲得最優(yōu)的工藝條件，這樣能有效減少工藝操作的盲目性，簡單易行、省時節(jié)能且提取效率高，為金櫻子鞣質(zhì)的開發(fā)利用提供實驗依據(jù)，對其他類藥材中鞣質(zhì)的提取有著一定的參考依據(jù)。

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（收稿日期：2014-11-14 本文編輯：衛(wèi) 軻）