顧國萍 張麗華

[摘要] 目的 探討急性心肌梗死大鼠心臟結(jié)區(qū)組織中連接蛋白（Cx30.2、Cx45）的表達(dá)。 方法 結(jié)扎大鼠冠狀動(dòng)脈左前降支建立急性心肌梗死模型，隨機(jī)分為模型組（MI組，n = 10）和假手術(shù)組（只穿線不結(jié)扎，SH組，n = 10）。術(shù)后4周取心臟標(biāo)本，采用免疫組化和逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）法檢測(cè)心臟結(jié)區(qū)組織中Cx30.2和Cx45蛋白及mRNA的表達(dá)。 結(jié)果 術(shù)后4周MI組Cx30.2和Cx45蛋白表達(dá)增加，分布不均，無規(guī)則，與SH組相比，蛋白表達(dá)差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P = 0.00）；Cx30.2和Cx45 mRNA在MI組的表達(dá)量亦增加，與SH組相比，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P = 0.00）；Cx30.2和Cx45 mRNA的表達(dá)具有明顯正相關(guān)（r = 0.938，P < 0.05）。 結(jié)論 急性心肌梗死后心臟結(jié)區(qū)組織中Cx30.2和Cx45表達(dá)增加，二者mRNA表達(dá)呈正相關(guān)。

[關(guān)鍵詞] 急性心肌梗死；連接蛋白30.2；連接蛋白45；免疫組化；逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)

[中圖分類號(hào)] R542.2 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210（2015）02（c）-0022-05

急性心肌梗死（acute myocardial infarction，AMI）因心肌缺血缺氧及缺血-再灌注損傷等可引起包括心律失常、心泵功能衰竭和心臟機(jī)械結(jié)構(gòu)破壞等多種并發(fā)癥，其中，心律失常是影響患者預(yù)后和生活質(zhì)量的重要因素之一，其發(fā)生機(jī)制尚不明確。國內(nèi)外大量研究認(rèn)為，多種機(jī)制參與了心律失常的發(fā)生及維持，如氧自由基的大量生成、Ca2+超載和細(xì)胞內(nèi)酸性物質(zhì)堆積等。隨著對(duì)心律失常研究的深入，目前認(rèn)為心肌細(xì)胞閏盤間縫隙連接的改變和心律失常的發(fā)生密切相關(guān)，是心律失常發(fā)生和維持的物質(zhì)基礎(chǔ)[1-3]。

縫隙連接（gap junction，GJ）介導(dǎo)著相鄰細(xì)胞間離子、小分子代謝物和信號(hào)分子（包括第二信使，如Ca2+、IP3、cAMP、cGMP等）的直接擴(kuò)散，進(jìn)而構(gòu)成相鄰細(xì)胞間電偶聯(lián)和代謝偶聯(lián)的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，使兩個(gè)相鄰細(xì)胞的細(xì)胞漿能夠進(jìn)行直接交換?？p隙連接由連接蛋白（connexins，Cxs）構(gòu)成，它的作用是介導(dǎo)相鄰細(xì)胞間電和生物化學(xué)信號(hào)的傳遞，為電興奮的順序傳播構(gòu)成細(xì)胞間的通路而調(diào)控心肌細(xì)胞的同步收縮。連接蛋白表達(dá)與分布的異常將導(dǎo)致相應(yīng)傳導(dǎo)速度和各向異性傳導(dǎo)發(fā)生變化，從而形成引起心律失常的環(huán)路。在大鼠的基因組中已經(jīng)確認(rèn)有20種連接蛋白基因[4]。每種Cxs都有其特定的表達(dá)區(qū)域，發(fā)揮著特異的功能，在心臟結(jié)區(qū)組織中表達(dá)的連接蛋白有Cx30.2和Cx45，發(fā)揮房室傳導(dǎo)延遲的作用，進(jìn)而保證心房、心室的同步有序收縮，目前尚未見到在動(dòng)物模型中二者表達(dá)變化的研究。本研究通過急性心肌梗死模型的建立，探討大鼠心臟結(jié)區(qū)組織中Cx30.2和Cx45的表達(dá)。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

HX-100E小動(dòng)物呼吸機(jī)，成都泰蒙科技有限公司；ASB240U生物信號(hào)采集分析系統(tǒng)，成都遨生電子有限公司；兔抗Cx30.2單克隆抗體（編號(hào)40-7400），Invitrogen公司；兔抗Cx45單克隆抗體，美國Santa公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及擴(kuò)增試劑盒，北京全式金生物技術(shù)有限公司；Cx30.2、Cx45和GAPDH（內(nèi)參）引物，北京賽百盛基因技術(shù)有限公司；基因擴(kuò)增儀，珠海黑馬醫(yī)學(xué)儀器有限公司；DYY-6C型電泳儀，北京六一儀器廠。

1.2 模型制備及動(dòng)物分組

選擇SPF級(jí)SD大鼠（鄭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證號(hào)410118），體重200～250 g，隨機(jī)分為模型組（MI組，n = 10）與假手術(shù)組（SH組，n = 10）。MI組：SD大鼠稱重后，用10%的水合氯醛溶液以300 mg/kg進(jìn)行腹腔注射麻醉，將大鼠背部固定在大鼠板上，備皮，消毒，連接多道生理信號(hào)采集處理系統(tǒng)，肢體導(dǎo)聯(lián)根據(jù)人體的傳統(tǒng)部位安放電極，用針電極刺入四肢皮下，監(jiān)測(cè)心電圖（electrocardiogram，ECG）。經(jīng)口氣管插管后接小動(dòng)物呼吸機(jī)，調(diào)整呼吸頻率為50～60次/min，潮氣量為3 mL/min，呼吸比3∶2。于胸骨左緣打開胸腔，破開心包，暴露心臟，以左冠狀靜脈為標(biāo)志， 距主動(dòng)脈根部2～3 mm處用6-0無創(chuàng)傷縫線穿過冠狀動(dòng)脈左前降支（left anterior descending，LAD）并結(jié)扎。結(jié)扎后遠(yuǎn)端局部心肌由鮮紅色變?yōu)榘导t色，隨后蒼白搏動(dòng)減弱，ECG示Ⅰ、aVL導(dǎo)聯(lián)J點(diǎn)偏移抬高，ST段抬高作為急性心肌梗死模型成功建立的標(biāo)志（ECG以標(biāo)準(zhǔn)化方法進(jìn)行心電參數(shù)測(cè)量[5]）。檢查無出血時(shí)間斷縫合肋骨層，并抽出胸腔內(nèi)氣體恢復(fù)胸腔負(fù)壓后逐層關(guān)胸。待大鼠出現(xiàn)自主呼吸拔出氣管插管。術(shù)后肌注青霉素40萬U/d，連用3 d預(yù)防感染。SH組于LAD下只穿線不結(jié)扎，余操作同模型組[6]。

1.3 取材

術(shù)后4周處死大鼠并迅速取出心臟，在兩組大鼠心臟結(jié)區(qū)垂直于心臟長軸分別切取兩塊厚度為3～4 mm的心肌組織作為標(biāo)本，一塊放入10%的中性福爾馬林溶液中，24 h后常規(guī)固定脫水、石蠟包埋，用于制備免疫組化樣品；另一塊迅速放入液氮中，隨后轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱用于提取RNA。

1.4 免疫組化法檢測(cè)大鼠心臟結(jié)區(qū)組織中Cx30.2和Cx45蛋白表達(dá)

免疫組化采用SP法，嚴(yán)格按照試劑盒說明操作，DAB顯色。用已知陽性切片做陽性對(duì)照，0.01 mol/L PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。

1.5 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）檢測(cè)大鼠心臟結(jié)區(qū)組織中Cx30.2和Cx45 mRNA表達(dá)

嚴(yán)格按照試劑盒說明提取RNA后逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，觀察電泳結(jié)果并照相。用Quantity One 軟件分析Cx30.2和Cx45條帶的灰度值，并以Rat GAPDH灰度值為標(biāo)準(zhǔn)校正，確定Cx30.2和Cx45 mRNA表達(dá)的相對(duì)含量。PCR擴(kuò)增基因引物序列及擴(kuò)增條件，見表1。

表1 Cx30.2、Cx45、Rat-GAPDH基因引物序列及擴(kuò)增條件

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)；Cx30.2和Cx45 mRNA表達(dá)水平的相關(guān)性分析采用Pearson檢驗(yàn)。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠急性心肌梗死模型建立成功的心電圖標(biāo)志

結(jié)扎LAD后10 min，ECG監(jiān)測(cè)顯示Ⅰ、aVL導(dǎo)聯(lián)J點(diǎn)偏移抬高，ST段抬高，初步說明大鼠急性心肌梗死動(dòng)物模型建立成功。術(shù)后4周處死大鼠時(shí)描記ECG示，相應(yīng)肢體導(dǎo)聯(lián)出現(xiàn)病理性Q波，伴R波振幅減低。見圖1。

2.2 免疫組化法檢測(cè)心臟結(jié)區(qū)組織中Cx30.2和Cx45蛋白表達(dá)情況

光鏡下見SH組心臟結(jié)區(qū)組織中Cx30.2和Cx45蛋白有少量表達(dá)，為棕黃色規(guī)律條帶狀分布；Cx30.2和Cx45蛋白在MI組表達(dá)增加，分布不均，無規(guī)則。分析結(jié)果顯示：與SH組相比，MI組Cx30.2和Cx45蛋白表達(dá)的平均光密度增強(qiáng)，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P = 0.00）。見圖2（封三）、表2。

2.3 RT-PCR法檢測(cè)心臟結(jié)區(qū)組織中Cx30.2和Cx45 mRNA表達(dá)情況

Cx30.2和Cx45 mRNA灰度值的變化趨勢(shì)是一致的，在急性心肌梗死時(shí)表達(dá)增加，見圖3。分析發(fā)現(xiàn)：與SH組相比，MI組Cx30.2和Cx45 mRNA表達(dá)的灰度值增加，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P = 0.00），見表2。Cx30.2和Cx45 mRNA表達(dá)相關(guān)性分析結(jié)果顯示：Cx30.2和Cx45 mRNA的表達(dá)呈明顯正相關(guān)（r = 0.938，P < 0.05），回歸方程為y=0.833x+0.016。見圖4。

1：MI組Cx45；2：SH組Cx45；3：MI組Cx30.2；4：SH組Cx30.2

圖3 Cx30.2和Cx45 mRNA表達(dá)情況

3 討論

心臟的正常激動(dòng)起源于竇房結(jié)，沿著特殊傳導(dǎo)系統(tǒng)（special conduction system，SCS）傳導(dǎo)至心房和心室，最后引起心房肌和心室肌細(xì)胞的同步收縮。而縫隙連接介導(dǎo)心肌細(xì)胞間電偶聯(lián)和代謝偶聯(lián)，為電興奮的順序傳播構(gòu)成細(xì)胞間的通路進(jìn)而調(diào)控心肌細(xì)胞的同步收縮。心臟的正常節(jié)律基本上是依賴于通過縫隙連接偶聯(lián)的心肌細(xì)胞。心臟正常節(jié)律的紊亂（心律失常）是很多心臟疾?。ㄈ缂毙孕募」Ｋ?、心力衰竭等）常見的、嚴(yán)重的甚至是致命的并發(fā)癥。細(xì)胞膜的異常導(dǎo)致動(dòng)作電位的改變?cè)谛穆墒С５陌l(fā)生中起重要作用，但是目前認(rèn)為縫隙連接及其構(gòu)成成分縫隙連接蛋白也起重要作用[7]。AMI后可以發(fā)生各種心律失常，包括緩慢性和快速性心律失常，甚至致命性心律失常，因此對(duì)AMI后縫隙連接蛋白的研究極為重要。既往對(duì)AMI后縫隙連接蛋白的研究集中在AMI后心室肌梗死區(qū)及梗死邊緣區(qū)Cx43及Cx45表達(dá)的變化，作為心臟結(jié)區(qū)組織中主要縫隙連接蛋白的Cx30.2和Cx45的研究主要在基因和細(xì)胞水平，尚未見到在動(dòng)物模型的心臟結(jié)區(qū)組織中Cx30.2和Cx45表達(dá)變化的研究。

激動(dòng)產(chǎn)生的心肌細(xì)胞及傳導(dǎo)系統(tǒng)的心肌細(xì)胞和心房、心室的收縮細(xì)胞在形態(tài)學(xué)甚至細(xì)胞間縫隙連接蛋白的表達(dá)分布上都有顯著的不同[8-9]。Cx30.2主要表達(dá)在大鼠的竇房結(jié)和房室結(jié)等心臟傳導(dǎo)系統(tǒng)中，研究發(fā)現(xiàn)，在Hela細(xì)胞中其構(gòu)成的縫隙連接通道的電導(dǎo)性是所有縫隙連接通道中最低的（9pS）。Kreuzberg等[1]研究證實(shí)，Cx30.2LacZ/LacZ大鼠的PQ間期比野生型同窩出生大鼠的PQ間期縮短了25%左右，應(yīng)用心內(nèi)電極記錄心房、希氏束及心室的電信號(hào)結(jié)果顯示：Cx30.2LacZ/LacZ型大鼠從心房到希氏束的傳導(dǎo)速度比Cx30.2+/+型大鼠明顯加快，心房和希氏束間期分別為（27.9±5.1）ms與（37.1±4.1）ms，而希氏束到心室的傳導(dǎo)速度沒有發(fā)生改變；另外，通過刺激Cx30.2LacZ/LacZ大鼠的心房誘導(dǎo)了房顫的發(fā)生，揭示Cx30.2LacZ/LacZ大鼠的房室結(jié)傳導(dǎo)加快和心室應(yīng)答率增加，進(jìn)而表明Cx30.2在減慢房室結(jié)沖動(dòng)傳播中發(fā)揮作用，且限制從心房傳導(dǎo)到心室的最大心搏頻率；對(duì)心房、心室的同步收縮發(fā)揮一定的作用，并在房性心動(dòng)過速等病理生理情況下阻止快速?zèng)_動(dòng)向心室的傳播而發(fā)揮保護(hù)作用，進(jìn)而減少血流動(dòng)力學(xué)的惡化。敲除Cx30.2基因的大鼠顯示，PQ間期縮短，表明Cx30.2延長房室傳導(dǎo)，其縮短房室傳導(dǎo)延遲時(shí)間是由于縮短AH間期而不是HV間期。通過研究經(jīng)基因敲除減少Cx30.2表達(dá)量的大鼠發(fā)現(xiàn)其房室結(jié)傳導(dǎo)速度加快。竇房結(jié)和房室結(jié)的細(xì)胞特異性表達(dá)少量的Cx45，在大鼠還表達(dá)有Cx30.2，這些縫隙連接蛋白在體外構(gòu)成低電導(dǎo)性的縫隙連接通道[10-11]。Cx30.2和Cx45在房室結(jié)的偶聯(lián)相對(duì)較少，這在房室結(jié)延遲傳導(dǎo)中起重要作用，進(jìn)而保證心室肌細(xì)胞的有序收縮。

心臟傳導(dǎo)系統(tǒng)組成了心肌細(xì)胞間電偶聯(lián)的特殊通道，該通道協(xié)調(diào)著整個(gè)心臟的沖動(dòng)傳播，它的異常導(dǎo)致各種形式的心律失常[12]。竇房結(jié)和房室結(jié)是哺乳動(dòng)物心臟傳導(dǎo)系統(tǒng)的重要組成部分，是控制與協(xié)調(diào)心臟電活動(dòng)的中心，進(jìn)而有序地協(xié)調(diào)著心房和心室的順序收縮。在竇房結(jié)和房室結(jié)的心肌細(xì)胞表達(dá)有Cx30.2和Cx45，這些Cxs在體外構(gòu)成低電導(dǎo)性的縫隙連接通道，且在房室結(jié)的偶聯(lián)相當(dāng)較少，這使其發(fā)揮房室結(jié)延遲傳導(dǎo)的作用[11，13]。在房室結(jié)縫隙連接蛋白的表達(dá)是復(fù)雜的，某些區(qū)域由不同的縫隙連接蛋白共同表達(dá)，如兔子房室結(jié)三維結(jié)構(gòu)顯示：在結(jié)區(qū)和移行細(xì)胞主要表達(dá)Cx45，而在希氏束、結(jié)后細(xì)胞及結(jié)后延伸細(xì)胞共同表達(dá)Cx45和Cx43[14]。故在竇房結(jié)功能失調(diào)時(shí)，房室結(jié)延遲房室沖動(dòng)傳播的作用可以保護(hù)心室免受快速心房率（比如房顫）的影響，另外房室結(jié)可作為潛在的起搏點(diǎn)控制心室的節(jié)律。通過基因敲除Cx30.2大鼠的試驗(yàn)進(jìn)一步揭示了Cx30.2在心臟的正常房室延遲傳導(dǎo)中是必需的[1]。Nikhil等[15]研究發(fā)現(xiàn)，Cx30.2和Cx40分別在房室傳導(dǎo)的慢傳導(dǎo)和快傳導(dǎo)中起著關(guān)鍵作用，而Cx45對(duì)Cx30.2和Cx40基因雙敲除大鼠擁有正常PR間期有重要的調(diào)控作用。在轉(zhuǎn)基因大鼠體內(nèi)，Cx45過表達(dá)導(dǎo)致了室性心律失常易感性的增加及細(xì)胞間偶聯(lián)的改變[16]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，急性心肌梗死后大鼠心臟結(jié)區(qū)組織中Cx30.2和Cx45蛋白的表達(dá)顯著增加，與SH組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P = 0.00），且分布紊亂不規(guī)律，這可能會(huì)影響心臟結(jié)區(qū)組織中Cx30.2和Cx45的偶聯(lián)；急性心肌梗死后心臟結(jié)區(qū)組織中Cx30.2和Cx45 mRNA表達(dá)較SH組亦明顯增高，且二者的表達(dá)變化呈正相關(guān)。提示Cx30.2和Cx45表達(dá)水平的異常升高可能與急性心肌梗死后易發(fā)室性心律失常有關(guān)。通過電壓膜片鉗技術(shù)對(duì)人類在體及鼠類離體心肌細(xì)胞縫隙連接通道電導(dǎo)的影響及轉(zhuǎn)染了Cx45的HeLa細(xì)胞的研究證實(shí)，抗心律失常肽AAP10及其衍生物ZP123對(duì)Cx45產(chǎn)生影響進(jìn)而發(fā)揮抗心律失常作用[17]。故需要對(duì)急性心肌梗死后縫隙連接蛋白的表達(dá)及改善縫隙連接蛋白表達(dá)進(jìn)行深入的研究。

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（收稿日期：2014-10-28 本文編輯：程 銘）