詹俊琳 于 力 張 俊 于生友

(1廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院兒科, 廣東 廣州 510260；2廣州市第一人民醫(yī)院兒科，廣東 廣州 510182)

·臨床研究·

腎病綜合征患兒外周血IL-17水平檢測(cè)的臨床意義

詹俊琳1于 力2*張 俊2于生友2

(1廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院兒科, 廣東 廣州 510260；2廣州市第一人民醫(yī)院兒科，廣東 廣州 510182)

目的:探討白細(xì)胞介素-17(IL-17)在激素敏感型腎病綜合征(SSNS)和激素依賴型腎病綜合征(SDNS)患兒外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)中檢測(cè)的臨床意義，并且闡明IL-17參與兒童NS的發(fā)病機(jī)制及臨床作用。方法:選擇2012年1月至2014年3月在廣州市第一人民醫(yī)院住院的原發(fā)性腎病綜合征(PNS)患兒47例，其中，SSNS 20例，SDNS27例，并選擇20例健康兒童為對(duì)照組。兩組患兒治療前和治療4周后分別采血檢測(cè)血清白蛋白(ALB)、總膽固醇(TC) 、甘油三酯(TG)、血尿素氮(BUN) 、血肌酐(Scr) 、血和尿β2- 微球蛋白(β2-MG)及24h尿蛋白定量檢測(cè)。應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)方法檢測(cè)PBMC在植物血凝素(PHA)刺激下培養(yǎng)液上清的IL-17濃度，分析IL-17濃度與24 h尿蛋白定量的相關(guān)性。結(jié)果:與治療前比較，SSNS組和SDNS組患兒的ALB、 TC、 TG、 BUN、 Scr、β2-MG以及24h尿蛋白定量水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；但兩組間比較，以上指標(biāo)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。治療前兩組患兒IL-17的濃度均明顯高于對(duì)照組(P<0.05)，治療后SDNS組IL-17濃度明顯高于SSNS組與對(duì)照組(P<0.05)。直線回歸分析顯示，治療前兩組患兒IL-17濃度與24 h尿蛋白值呈正相關(guān)(r=0.949，P<0.01)；治療后SDNS組IL-17濃度下降值與24 h尿蛋白定量下降值呈正相關(guān)(r=0.767，P<0.01)。結(jié)論:IL-17在兒童PNS的發(fā)生發(fā)展中起著一定的作用，推測(cè)IL-17可能是引起NS患兒激素依賴的重要原因，因此監(jiān)測(cè)IL-17濃度的變化可以作為觀察兒童PNS療效的一個(gè)重要臨床指標(biāo)。

腎病綜合征；白細(xì)胞介素17；外周血單個(gè)核細(xì)胞

原發(fā)性腎病綜合征(primary nephrotic syndrome，PNS)是兒童腎臟病中最常見的一種腎小球疾病，大部分兒童PNS對(duì)激素治療敏感，但也有40%患兒會(huì)出現(xiàn)復(fù)發(fā)[1]。對(duì)于這類患兒，需要重新使用足量激素、延長(zhǎng)激素使用時(shí)間或者聯(lián)合使用其他的免疫抑制劑，這些治療措施會(huì)帶來(lái)生長(zhǎng)抑制、腫瘤發(fā)生率增加等副作用。因此，我們需要從發(fā)病機(jī)制研究這部分激素依賴的腎病綜合征患兒，尋找副作用更小的治療方法。目前有研究[2]表明白細(xì)胞介素-17(IL-17)在PNS的發(fā)病機(jī)制中占有一定作用，所以，本研究探討IL-17與PNS患兒產(chǎn)生激素依賴的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選擇2012年1月至2014年3月在廣州市第一人民醫(yī)院兒科住院的PNS患兒47例，其中，SSNS 20例，SDNS 27例；男29例，女18例；年齡2～14歲，中位年齡6歲；腎炎性腎病31例，單純性腎病16例；健康兒童為對(duì)照組20例。

1.2 診斷標(biāo)準(zhǔn)

全部NS患兒均符合2009年中華醫(yī)學(xué)會(huì)兒科分會(huì)腎臟病學(xué)組制定的《激素敏感、復(fù)發(fā)/依賴腎病綜合征診治循證指南(試行)》PNS診斷標(biāo)準(zhǔn)[3]。

1.3 觀察指標(biāo)

觀察SSNS和SDNS患兒治療前和治療4周后各項(xiàng)生化指標(biāo)：血清白蛋白(ALB)、總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、血尿素氮(BUN)、血肌酐(Scr) 、血和尿β2- 微球蛋白(β2-MG)以及24 h尿蛋白定量檢測(cè)。

1.4 PBMC上清液中IL-17濃度檢測(cè)

1.4.1 IL17標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 人IL-17藥盒購(gòu)自深圳晶美生物工程有限公司。將試劑盒標(biāo)準(zhǔn)品(凍干品)每瓶以樣品稀釋液稀釋至300 μL，濃度為50 pg/mL，靜置10 min以上，再進(jìn)行系列倍比稀釋，分別稀釋成不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品50.00、25.00、12.50、6.25、3.12、1.56、0.78 pg/mL，其原液作為最高標(biāo)準(zhǔn)濃度，樣品稀釋液直接作為標(biāo)準(zhǔn)濃度0，臨用前15 min內(nèi)配置。分別設(shè)空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔、待測(cè)樣品孔加樣，酶標(biāo)板加蓋或覆膜，置于37 ℃條件120 min后，棄孔內(nèi)液，甩干。每孔加檢測(cè)溶液A工作液100 μL，溫育60 min，棄孔內(nèi)液，甩干，專用洗滌液洗板3次，每次加入洗滌液350 μL/孔，浸泡(1～2)min，甩干；每孔加檢測(cè)溶液B工作液100 μL，溫育60 min，棄孔內(nèi)液，甩干洗板，每次浸泡(1～2)min，350 μL/孔，甩干；依序每孔加底物液90 μL，37 ℃避光顯色，依序加中止液50 μL/孔，終止反應(yīng)，用酶聯(lián)儀在450 nm處讀IL-17表達(dá)，加中止液后15 min內(nèi)檢測(cè)。各孔(包括零孔)吸光度(A)值應(yīng)減去零孔(標(biāo)準(zhǔn)濃度)的A值。以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，A值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)標(biāo)本A值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上測(cè)IL-17含量。

1.4.2 PBMC培養(yǎng)與IL-17檢測(cè) 取清晨空腹靜脈血4 mL，置抗凝管，經(jīng)離心后分離PBMC，調(diào)整細(xì)胞濃度至2×106/mL，用臺(tái)盼藍(lán)拒染法觀察細(xì)胞活性。在培養(yǎng)液中加入植物血凝素(PHA,20 μg/mL)，37 ℃和5%CO2條件下培養(yǎng)48 h，分別于PHA刺激12、24和48 h收集細(xì)胞與上清液。應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)方法進(jìn)行培養(yǎng)液上清IL-17濃度的檢測(cè)。

1.5 病理改變

SDNS患兒部分接受腎穿刺活檢，病理診斷分別是局灶節(jié)段性腎小球硬化(FSGS)3 例，輕度系膜增生性腎小球腎炎(MsPGN)6例，中度MsPGN 4例及膜性腎病(MN)3例，因?yàn)椴±?，未納入統(tǒng)計(jì)分析。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 生化指標(biāo)變化

與治療前比較，治療后SSNS組患兒和SDNS組患兒的ALB明顯升高，TC 、TG、BUN 、Scr 、血和尿β2-MG以及24h尿蛋白定量均顯著下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；但上述各項(xiàng)觀察指標(biāo)在兩組患兒間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 SSNS和SDNS治療前、后兩組血液生化與尿蛋白指標(biāo)的變化±s)

注：與治療前(0周)相比，*P<0.05

2.2 IL-17濃度變化

治療前兩組患兒與對(duì)照組比較，IL-17的濃度均明顯升高(P<0.05)；治療后SDNS組IL-17濃度明顯高于SSNS組和對(duì)照組(P<0.05)。見表2。

表2 各組血IL-17的水平變化

注：與對(duì)照組比較，*P<0.01;與SSNS組4周時(shí)間比較，#P<0.05

2.3 IL-17與24 h尿蛋白的關(guān)系

直線回歸分析顯示，治療前兩組患兒IL-17濃度與24 h尿蛋白值呈正相關(guān)(r=0.949，P<0.01)，見圖1；治療后SDNS組IL-17濃度下降值與24 h尿蛋白定量下降值呈正相關(guān)(r=0.767，P<0.01)，見圖2。

圖1 治療前IL-17濃度與尿蛋白定量值直線回歸分析結(jié)果

圖2 治療后SDNS組IL-17濃度下降值與24 h尿蛋白下降值直線回歸分析結(jié)果

3 討 論

白細(xì)胞介素17(interleukin17, IL-17)是由155個(gè)氨基酸組成的半球形糖蛋白，相對(duì)分子質(zhì)量為35kDa[4]，由輔助性T淋巴細(xì)胞(Th17細(xì)胞)合成，能夠促進(jìn)趨化因子分泌、募集炎癥因子。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明在哺乳類動(dòng)物中，IL-17是機(jī)體防御細(xì)菌及真菌感染的重要炎癥因子，而且IL-17還參與了機(jī)體自身免疫防御的發(fā)病過(guò)程，例如哮喘、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎及系統(tǒng)性紅斑狼瘡等[4-6]。Liu等[7]發(fā)現(xiàn)在微小病變合并急性腎衰竭的腎病綜合征患者，IL-17的表達(dá)明顯增加，而Th17/Treg的比例在激素治療起效后恢復(fù)正常。國(guó)內(nèi)楊青梅等[8]在原發(fā)性IgA腎病患者中發(fā)現(xiàn)外周血中IL-17的表達(dá)與病理組織中腎小球新月體形成有明顯相關(guān)，可能成為腎小球損傷新的標(biāo)志物和預(yù)后判斷指標(biāo)。在腎移植患者[9]中，IL-17旁路是環(huán)孢素A等免疫抑制治療失敗(抑制TH1/IFN-y通路)的免疫逃逸通路。還有研究表明[10]，微小病變型(MCD)的NS患者尿中的IL-17濃度升高，在NS緩解后，濃度顯著下降。這些研究均表明IL-17在腎病的發(fā)病機(jī)制中有重要作用。

腎小球病也是一種自身免疫調(diào)節(jié)紊亂相關(guān)的疾病，本研究發(fā)現(xiàn)在PNS患兒中，治療前PBMC表達(dá)IL-17的濃度較正常兒童明顯升高，證明IL-17在PNS的發(fā)病機(jī)制中占有一定的作用，這與Matsumoto等[10]的結(jié)果相一致，他們發(fā)現(xiàn)在MCD的PNS中，激素治療前，患者尿中的IL-17排出明顯增多，經(jīng)治療起效后，尿中IL-17排出減少。此外，還有研究[11]發(fā)現(xiàn)，在PNS患兒中，血IL-17及尿IL-17與尿蛋白的排泄呈正相關(guān)，我們的研究也證實(shí)了治療前PBMC中的IL-17濃度與24h尿蛋白定量值明顯相關(guān)，這說(shuō)明的IL-17的濃度還可能與疾病活動(dòng)的嚴(yán)重程度有關(guān)，并且是導(dǎo)致腎損傷的因素之一。目前已經(jīng)在動(dòng)物模型[5,12]及人類[13,14]的研究中發(fā)現(xiàn)，IL-17在疾病的活動(dòng)期，會(huì)促進(jìn)中性粒細(xì)胞的聚集，引發(fā)機(jī)體的免疫防御反應(yīng)，一方面增強(qiáng)宿主免疫防御反應(yīng)，但另一方面也會(huì)導(dǎo)致機(jī)體自身的損傷；而在人類的自身免疫性疾病中[15]，例如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，IL-17能夠激活破骨細(xì)胞，導(dǎo)致關(guān)節(jié)損傷。而有研究者[16]在PNS的腎臟組織中檢測(cè)到IL-17，說(shuō)明IL-17可能在腎組織的損傷的部位發(fā)揮一定的作用。

本研究分析了20例SSNS患兒和27例SDNS患兒治療前后IL-17濃度變化以及與24h尿蛋白定量值的關(guān)系。治療前兩組患兒間IL-17濃度及24h尿蛋白定量值無(wú)明顯差異；治療后SDNS組IL-17濃度明顯高于SSNS組，兩組患兒尿蛋白均下降，組間比較無(wú)明顯差異。直線回歸分析顯示，治療前IL-17濃度與尿蛋白定量值呈正相關(guān)，說(shuō)明IL-17是導(dǎo)致尿蛋白產(chǎn)生的原因之一。激素治療4周后，我們發(fā)現(xiàn)SSNS患兒PBMC中IL-17的濃度明顯下降，但SDNS患兒即使在血生化指標(biāo)恢復(fù)正常的情況下，IL-17仍然明顯升高，這說(shuō)明了IL-17可能在PNS患兒產(chǎn)生激素依賴的機(jī)制中具有重要作用。

因此，本實(shí)驗(yàn)證實(shí)IL-17在兒童PNS的發(fā)生發(fā)展中起著一定的作用。通過(guò)IL-17濃度變化與24h尿蛋白定量值的關(guān)系，推測(cè)IL-17可能是引起SDNS患兒復(fù)發(fā)的重要原因之一。監(jiān)測(cè)治療后IL-17濃度的變化可以作為觀察兒童PNS療效的重要臨床指標(biāo)。

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(本文編輯:王馨)

Clinical significance of interleukin-17 expression level in peripheral blood of children with nephrotic syndrome

ZhanJunlin1,Yuli2,Zhangjun2,YuShengyou2

(1DepartmentofPediatrics,SecondAffiliatedHospitalofGuangzhouMedicalUniversity,Guangzhou510260;2DepartmentofPediatrics,GuangzhouFirstMunicipalPeople’sHospital,Guangzhou510182,China)

Objective:To investigate the clinical significance of interleukin-17 (IL-17) in peripheral blood mononuclear cells (PBMC) of children with steroid-sensitive nephrotic syndrome (SSNS) and steroid-dependent nephritic syndrome (SDNS). Methods: 47 children with primary nephrotic syndrome (PNS), who were hospitalized in Guangzhou First Municipal People’s Hospital between January 2012 and March 2014 were recruited, including 20 with SSNS and 27 with SDNS. 20 healthy children were included as the control group. Venous blood of both groups were collected for the measuvemeat of serum albumin (ALB), total cholesterol (TC), triglyceride (TG), blood urea nitrogen (BUN), serum creatinine (Scr), serum and urinary β2-microglobulin (β2-MG) and 24h urinary protein quantitation were determined before and 4 weeks after the treatment, respectively. Enzyme linked immunosorbent assay was used to determine the concentration of IL-17 in PBMC of the medium supernatant under the stimulation of phytohemagglutinin (PHA).The correlation between IL-17 and 24h urinary protein was analyzed.Results:There were statistically significant differences in the levels of ALB, TC, TG, BUN, Scr, β2-MG and 24h urinary protein quantitation in SSNS group and SDNS group after the treatment compared with those before the treatment (P<0.05). However, no statistically significant differences were found in the parameters between the two groups. The IL-17 concentration in the two NS groups was significantly higher than that in the control group before the treatment (P<0.05), whereas the IL-17 concentration in the SDNS group was significantly higher than that in the SSNS group and control group after the treatment (P<0.05). Linear regression analysis showed that the IL-17 concentration was positively correlated with 24h urinary protein quantitation in the two groups before the treatment (r=0.949,P<0.01). And positive correlation was found in the decreasing value between IL-17 concentration and 24h urinary protein quantitation in SDNS group after the treatment (r=0.767,P<0.01). Conclusion: IL-17 has certain effects in the occurrence and development of PNS in children, which may be an important cause of SDNS in children. Then, the change of IL-17 could be a significant clinical index to investigate the efficacy of treating PNS children.

nephritic syndrome; interleukin-17; peripheral blood mononuclear cell

10.3969/j.issn.2095-9664.2015.01.007

詹俊琳(1979-)，女，本科，講師。

R726.9

A

2095-9664(2015)01-0024-04

2014-06-23)

研究方向：腎小球病的發(fā)病機(jī)理。

*通訊作者:E-mail：yuli828@yeah.net