高玉榮，徐國棟，李大鵬，王洪江，張麗媛，劉偉，盧旭華

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學食品學院，大慶 163319；2.黑龍江農(nóng)墾寶泉嶺香其醬業(yè)有限公司）

豆豉是以黑豆或大豆為材料，經(jīng)過微生物發(fā)酵而成的一種具有傳統(tǒng)歷史的發(fā)酵食品[1]。豆豉不僅可以用于烹調(diào)，也可替代菜供人們食用[2]。依據(jù)豆豉制曲工藝中所使用微生物的不同，豆豉可分為毛霉、根霉、曲霉和細菌型豆豉[3]。

豆豉的發(fā)酵過程是利用在制曲過程中由微生物代謝產(chǎn)生的蛋白酶等酶系分解大豆中的蛋白質(zhì)、淀粉、結(jié)合態(tài)異黃酮等物質(zhì)，生成氨基酸、糖和游離態(tài)異黃酮等，再經(jīng)過一些生化反應，從而使豆豉具有獨特的風味和營養(yǎng)[4-5]。但目前傳統(tǒng)工藝制得的豆豉中游離態(tài)異黃酮含量很低，主要是以與糖苷結(jié)合態(tài)形式存在[6-8]。通過糖苷酶可將結(jié)合態(tài)的異黃酮水解成的游離態(tài)的異黃酮苷元小物質(zhì)，游離態(tài)異黃酮在預防癌癥、預防骨質(zhì)疏松、預防心血管疾病等方面具有較好效果[9]。

為了制備富含游離態(tài)異黃酮的豆豉，實驗以前期篩選的高產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的菌株為制曲菌種，以蛋白酶活力與β-葡萄糖苷酶活力為指標，通過單因素和響應面法進行豆豉制曲工藝優(yōu)化，以期為富含游離異黃酮的功能性豆豉的工業(yè)化生產(chǎn)提供理論參考與數(shù)據(jù)支持。

1 材料與設(shè)備

1.1 菌種

曲霉：D30，自行篩選獲得，β-葡萄糖苷酶酶活達到257.621 U·L-1，黑龍江八一農(nóng)墾大學食品學院實驗保藏。

1.2 材料與試劑

黃豆為市售；Folin-酚試劑，上海三杰生物技術(shù)有限公司；pNPG，北京諾博萊德科技有限公司，均為分析純。

1.3 儀器與設(shè)備

722S型可見分光光度計，沈陽市博騰儀器設(shè)備有限公司；BSA224S型電子分析天平，德國賽多利斯公司；XFH-50MA型電熱式壓力蒸汽滅菌鍋，深圳市鼎鑫宜實驗設(shè)備有限公司；HH-S4型電熱恒溫水浴鍋，常州市萬合儀器制造有限公司。

2 實驗方法

2.1 制曲工藝的單因素實驗

選擇顆粒飽滿均勻、無蟲蝕的新鮮大豆，加入大豆質(zhì)量2倍的水，25℃浸泡8 h。121℃蒸煮35min，冷卻至35℃進行制曲[10]。以蛋白酶和β-葡萄糖苷酶活力為指標，采用單因素實驗研究接種量、制曲溫度、制曲時間對制曲的影響。每個處理重復3次，取平均值。

2.2 三元二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合實驗設(shè)計

在單因素實驗基礎(chǔ)上，以蛋白酶和β-葡萄糖苷酶酶活性為指標，進行三元二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合實驗設(shè)計，數(shù)據(jù)用Design-Expert 8.0.6軟件處理，確定最優(yōu)制曲工藝參數(shù)。

2.3 酶活力測定

蛋白酶活力測定：采用Folin-酚法[11]。β-葡萄糖苷酶活力測定：采用比色法[12]。

2.4 統(tǒng)計學分析

3 結(jié)果與分析

3.1 富含游離異黃酮豆豉的制曲工藝的單因素實驗

豆豉制曲的目的主要是產(chǎn)生大量的蛋白酶，在發(fā)酵過程中可將大豆中的蛋白質(zhì)水解成氨基酸。為了制備富含游離異黃酮的豆豉，豆曲中不僅要含有較高的蛋白酶活性，而且要含有較高的β-葡萄糖苷酶的活性[13]。因此，實驗以蛋白酶活力和β-葡萄糖苷酶活力為指標，進行富含游離異黃酮豆豉的制曲工藝研究。

3.1.1 接種量對制曲工藝的影響

每克冷卻的黃豆分別接種 104、105、106、107、108個孢子，28℃培養(yǎng)3 d，測定蛋白酶活力和β-葡萄糖苷酶活力，實驗結(jié)果如圖1所示。

圖1 接種量對酶活力的影響Fig.1 Effects of inoculation amount on enzyme activity注：a～e代表不同接種量對蛋白酶活性的差異顯著性，v～z代表不同接種量對β-葡萄糖苷酶活性的差異顯著性，字母不同表示差異顯著（P＜0.05），字母相同表示差異不顯著（P＞0.05）。

從圖1可以看出，在104～106個孢子·g-1黃豆范圍內(nèi)，接種量對蛋白酶活力和β-葡萄糖苷酶活力影響顯著（P＜0.05）。隨著接種量的增加，酶活呈先升高后下降的趨勢，這是因為當接種量過大時，菌種生長消耗了大量的營養(yǎng)物質(zhì)，影響了代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生，導致酶活力降低，因此單因素確定適宜的接種量為106個孢子·g-1黃豆。

3.1.2 溫度對制曲工藝的影響

每克冷卻的黃豆接種106個孢子，分別在24、28、32、36、40℃下培養(yǎng)3 d，測定蛋白酶和β-葡萄糖苷酶活力，實驗結(jié)果如圖2所示。

圖2 制曲溫度對酶活力的影響Fig.2 Effects of koji-making temperature on enzyme activity注：a～c代表不同的制曲溫度對蛋白酶活性的差異顯著性，x～z代表不同制曲溫度對β-葡萄糖苷酶的差異顯著性，字母不同表示差異顯著（P＜0.05），字母相同表示差異不顯著（P＞0.05）。

從圖2可以看出，在實驗選取的溫度范圍內(nèi)，溫度對蛋白酶活力和β-葡萄糖苷酶活力影響顯著（P＜0.05）。蛋白酶活力最大的溫度為28℃，β-葡萄糖苷酶活力最大的溫度為32℃，因此，單因素實驗確定的制曲溫度范圍為28～32℃。

3.1.3 時間對制曲工藝的影響

每克冷卻的黃豆接種106個孢子，在28℃下分別培養(yǎng)1、2、3、4、5 d，測定蛋白酶和β-葡萄糖苷酶活力，實驗結(jié)果如圖3所示。

圖3 制曲時間對酶活力的影響Fig.3 Effects of koji-making time on enzyme activity注：a～c代表不同制曲時間對蛋白酶活性的差異顯著性，x～z代表不同制曲溫度對β-葡萄糖苷酶的差異顯著性，字母不同表示差異顯著（P＜0.05），字母相同表示差異不顯著（P＞0.05）。

從圖3可以看出，制曲時間對蛋白酶活力和β-葡萄糖苷酶活力的影響顯著（P＜0.05）。在1～3 d范圍內(nèi)，隨著時間的延長，酶活性逐漸升高，當制曲時間大于3 d，兩種酶活力開始下降。這是由于制曲后期，曲霉生長進入衰亡期，代謝能力減慢，并有一部分酶發(fā)揮酶解作用，從而使曲中總酶含量減少。因此根據(jù)單因素確定適宜的制曲時間為3 d。

3.2 響應面法優(yōu)化制曲工藝條件

在單因素實驗的基礎(chǔ)上，選擇接種量、制曲溫度、制曲時間作為自變量，以蛋白酶活力和β-葡萄糖苷酶活力作為指標，進行二元三次旋轉(zhuǎn)組合實驗，因素編碼及實驗結(jié)果見表1和表2[14]。

采用Design-Expert 8.0.6對實驗數(shù)據(jù)進行回歸分析，得到蛋白酶活性（y1）、β-葡萄糖苷酶活性（y2）與接種量（x1）、制曲溫度（x2）和制曲時間（x3）編碼值的二次回歸方程如下：

表1 因素水平編碼Table 1 Coding table of factor level

表2 響應面實驗設(shè)計及結(jié)果Table 2 Experimental design and results of response surface

續(xù)表2 響應面實驗設(shè)計及結(jié)果Continued table 2 Experimental design and results of response surface

蛋白酶活性模型的決定系數(shù)R2=0.919 4，校正R2=0.863 6，β-葡萄糖苷酶活性模型的決定系數(shù)R2= 0.930 5，校正R2=0.882 4。

表3 蛋白酶活性方差分析Table 3 Variance analysis of protease activity

表4 β-葡萄糖苷酶活性方差分析Table 4 Variance analysis ofβ-glucosidase activity

由表3和表4可以看出蛋白酶活性模型的F值為16.48，P＜0.000 1，模型極顯著，失擬項的P值為0.579 8，大于0.05，說明該模型擬合程度較好，可用此模型對制曲工藝條件進行優(yōu)化。影響蛋白酶酶活力的因素主次順序依次為：制曲時間＞制曲溫度＞接種量。

β-葡萄糖苷酶活性模型的F值為19.35，對應的P＜0.000 1，說明模型極顯著，失擬項的P值為0.551 7，大于0.05，說明該模型擬合程度較好，可用此模型對制曲工藝條件進行優(yōu)化。影響β-葡萄糖苷酶活力因素主次順序依次為：制曲溫度＞接種量＞制曲時間。

為了得到最佳的制曲條件，分析蛋白酶和β-葡萄糖苷酶模型，進入 Design-Expert軟件，選擇Numerical選項，在Criteria選項下，將兩種酶活性設(shè)置為maximize，得到最優(yōu)的蛋白酶和β-葡萄糖苷酶活力的制曲條件：接種量為105.36個孢子·g-1大豆、制曲溫度為26.48℃、制曲時間為4 d，理論的蛋白酶酶活力為 638.44 U·g-1，β-葡萄糖苷酶活力254.10 U·g-1。

3.3 驗證實驗

根據(jù)優(yōu)化的結(jié)果，取最佳制曲條件為接種量105.4（約為2.5×105）個孢子·g-1大豆，制曲溫度26.5℃，制曲時間4 d，進行三次驗證實驗，實驗結(jié)果見表5。

表5 驗證實驗結(jié)果Table 5 Results of test plans

由表5可以看出，在最佳的制曲條件下，豆曲中蛋白酶和β-葡萄糖苷酶活力分別為623.17 U·g-1和245.24 U·g-1。

4 結(jié)論

（1）接種量、發(fā)酵溫度和發(fā)酵時間對豆曲中蛋白酶和β-葡萄糖苷酶的活力影響顯著（P＜0.05）。

（2）采用三元二次正交旋轉(zhuǎn)組合實驗設(shè)計對制曲工藝進行優(yōu)化，確定最佳的制曲工藝條件為接種量105.4個孢子·g-1大豆、制曲溫度26.5℃、制曲時間4 d，在此條件下，β-葡萄糖苷酶酶活力為245.24 U·g-1，蛋白酶酶活力為623.17 U·g-1，為富含游離態(tài)異黃酮豆豉的制備奠定了基礎(chǔ)。

［1］林曉華.曲霉型豆豉的發(fā)酵條件及揮發(fā)性成分的研究［D］.南昌：南昌大學，2013.

［2］陳廷濤.發(fā)酵乳和豆豉中微生物菌群DGGE分析及益生作用研究［D］.南昌：南昌大學，2013.

［3］蔣立文.發(fā)酵豆豉的研究進展［J］.食品安全質(zhì)量檢測學報，2013，4（6）：1803-1809.

［4］孫森，宋俊梅，曲靜然.豆豉后發(fā)酵過程中微生物菌相的變化［J］.中國食品添加劑，2008，87（2）：139-143.

［5］張建華.曲霉型豆豉發(fā)酵機理及其功能性的研究［D］.北京：中國農(nóng)業(yè)大學，2003.

［6］錢麗麗，左鋒，唐彥軍.大豆異黃酮提取方法的研究進展［J］.黑龍江八一農(nóng)墾大學學報，2006，18（5）：64-67.

［7］劉錦繡.豆豉混菌發(fā)酵及其功能成分的研究［D］.泰安：山東農(nóng)業(yè)大學，2013.

［8］齊斌，劉賢金.產(chǎn)大豆異黃酮β-葡萄糖苷酶菌株的篩選及酶學性質(zhì)研究［J］.食品科學，2007，28（8）：290-293.

［9］李寧.影響大豆異黃酮抗氧化活性的物理因素及其生物學功效的研究［D］.哈爾濱：東北農(nóng)業(yè)大學，2008.

［10］劉勤華，馬漢軍.香辛料對醬鴨醬制工藝的影響究［J］.河南科技學院學報：自然科學版，2014，42（1）：12-15.

［11］繆素娜，鄧少雅，譚麗賢，等.一種測定醬油曲中蛋白酶活力方法研究［J］.中國釀造，2014，33（2）：37-41.

［12］劉穎，劉婧美，王佳瑞，等.傳統(tǒng)發(fā)酵豆醬高β-葡萄糖苷酶活力制曲工藝研究［J］.食品與機械，2009，134（6）：134-137.

［13］劉婧美.富含大豆異黃酮苷元營養(yǎng)型豆醬生產(chǎn)工藝研究［D］.哈爾濱：哈爾濱商業(yè)大學，2010.

［14］楊麗娟，陸海燕，貝麗霞，等.響應面法優(yōu)化副干酪乳桿菌增菌培養(yǎng)基［J］.黑龍江八一農(nóng)墾大學學報，2013，25（1）：1-6.