賀旺林，俞龍浩

（黑龍江八一農墾大學食品學院，大慶 163319）

隨著消費者逐漸追求天然、安全、高質的低溫肉制品，所以高溫肉制品逐漸被風味和營養(yǎng)齊全的低溫肉制品取代。低溫肉制品[1]是指在常壓下通過蒸、煮、熏、烤等加工工藝，使肉加工熟制時介質的溫度低于100℃、產品中心溫度達到72～85℃，保持30min，成品的運輸、貯藏、銷售要求在低溫（0～4℃）條件下的肉制品。低溫肉制品經熱加工后仍然殘存著真菌孢子、細菌芽孢和部分耐熱細菌，低溫肉制品本身營養(yǎng)豐富、水分活度高，有利于微生物的生長和繁殖；再加上銷售、運輸和冷鏈貯藏條件的不完善，所以低溫肉制品極易發(fā)生腐敗變質。低溫肉制品的貨架期（shelf-life，SL）[2]是指低溫肉制品貯藏在冷鏈條件下，能夠保證安全和確保理想的感官、理化、微生物特性以及標簽聲明的營養(yǎng)值的一段時間。貨架期預測技術克服了傳統(tǒng)理化分析的滯后性，能夠有效地控制肉類生產企業(yè)的經濟損失以及為消費者的健康提供保障。由于低溫肉制品貨架期限制的主要因子是微生物，所以以計算機為基礎，描述特定環(huán)境下各種微生物的消長情況，借此預測細菌的生長、殘存、 死亡情況的預報微生物學（predictive microbiology，PM）[3]是低溫肉制品貨架期預測的主體部分。從特定產品出發(fā)，建立大量的微生物動力學生長模型后，通過計算機和配套軟件，無需進行繁瑣的分析檢測就可快速地預知產品的貨架期。

據估測，全球約25%的食物因發(fā)生微生物腐敗而損失[4]。為了有效地控制損失，預報微生物學激起了全球研究者的興趣，有關各種食品預測微生物學的研究報道呈增多的趨勢，但主要集中在水產品和冷鮮肉方面，然而有關低溫肉制品的預報微生物學研究鮮有報道。在預測微生物學探索過程中，國內外的研究者逐漸明確主要從以下三大方面進行研究：一是食品儲藏過程中的菌相分析；二是結合環(huán)境因子，建立特定腐敗微生物的動力學生長模型和開發(fā)適用的貨架期預測軟件[5]；最后是對建立的生長模型和預測軟件進行驗證、改良。其中菌相分析是微生物預測技術的主體，所以菌相分析方面的研究內容較多。主要綜述了貨架期預測的主要技術及其應用現狀，旨在為肉類生產企業(yè)提供借鑒和參考，進而使低溫肉制品的生產銷售鏈趨于健全和完善。

1 菌相分析

國內外許多研究結果表明，低溫肉制品初始帶菌量一般為102～103cfu·g-1[6-7]，然而初始菌相中占有優(yōu)勢的微生物對產品的腐敗變質不一定起主導作用。僅僅用細菌總數很難評估肉及其制品的腐敗程度，如在低溫條件下致使冷鮮肉腐敗可接受的最高水平是107～109cfu·g-1，肉制品中約107～108cfu·g-1，微生物數量只是一個大概的范圍[8-11]，研究室研究紅腸儲藏過程中菌落總數的結果表明，菌落總數作為微生物腐敗變質的準確評定標準是不可靠的。事實上，決定產品質量的微生物為腐敗微生物，其數量增加或代謝產物的積累將會影響產品質量。因此，可以通過過程參數針對性地限制腐敗微生物的生長，來控制產品的貨架期。

確定特定腐敗菌（specific spoilage organism，SSO）對預測和控制產品質量極為重要[12]，通過分析肉制品在儲藏過程中的菌相及其變化進而確定肉制品在特定環(huán)境下的SSO。目前鑒定SSO的方法分為兩大類：一是傳統(tǒng)的生理生化鑒定方法，二是新興的生物學系統(tǒng)技術。

1.1 肉制品中主要腐敗菌

食品中的菌相分析和確定特定產品中的SSO及其腐敗限是微生物預測技術的前提條件，預測微生物學中的菌相分析最初主要集中在食品中的一些病原菌（單核增生李斯特菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌等），隨著研究的深入發(fā)現致病菌的數量在腐敗的過程中并未得到大量增加，因此致病菌并不是引起食物腐敗變質的根源。早在20世紀90年代中期研究發(fā)現水產品在捕獲時存在多種微生物，但是只有很少一部分細菌參與腐敗過程，這些適合生存繁殖并產生腐敗臭味代謝產物的菌群，就是該產品的SSO[13]。

國外有關低溫肉制品SSO的研究較早，研究發(fā)現儲藏初期，SSO所占比率可能不高，但對環(huán)境的忍耐力強、生長繁殖快、腐敗活性強。目前已經確定了真空包裝低溫肉制品中的SSO主要是乳酸菌[14-17]。近年來，國內有關肉制品SSO的研究報道呈增多的趨勢，并且國內的研究結果與國外基本相近。綜合國內外的研究結果，乳酸菌是真空包裝低溫肉制品中的優(yōu)勢腐敗菌群，其他次要菌群主要有腸桿菌[16]和熱殺索絲菌[18]等，其中次要菌群和特定產品的加工和儲藏環(huán)境有關。有關特定腐敗菌的腐敗特征見表1。

表1 各種腐敗菌細菌腐敗特性Table 1 All kinds of corruption bacteria spectrum

1.2 傳統(tǒng)菌相分析技術

特定腐敗菌的常規(guī)鑒定方法是利用選擇性培養(yǎng)基對其進行培養(yǎng)和分離純化，通過觀察菌株的菌落形態(tài)（大小、顏色、有無鞭毛等）、微觀結構、生化特征（革蘭氏染色、營養(yǎng)類型、最適生長條件等），然后查閱細菌鑒定手冊（《伯杰氏細菌鑒定手冊》、《常見細菌鑒定手冊》等），基本上可以準確鑒定到屬，并且有的研究者提出對產品貨架期的預測研究，準確鑒定到屬即可。這種傳統(tǒng)的方法，對設備技術要求不高，常規(guī)實驗室都能完成，所以該方法被廣泛應用。但是生理生化鑒定不但耗時、操作繁瑣而且主觀因素影響較大，通常需要經驗豐富的微生物專家才能得到準確鑒定，所以往往都是在生理生化鑒定的基礎上結合16S rRNA分子生物學方法進行鑒定，得到的結果相對準確可靠。

16S rRNA技術在微生物鑒定的應用中極其廣泛，幾乎所有涉及到微生物的領域都有所應用。在肉品方面，Andrase等[23]利用16S rRNA鑒定發(fā)現伊比利亞火腿表面出現的“黑斑”是假單胞菌（Pseudomonas sp.）引起的；金鑫[24]對冷卻豬肉儲藏過程中的菌相分析也是利用了16S rRNA技術。利用傳統(tǒng)的培養(yǎng)分離純化技術結合16S rRNA技術在基因水平上的鑒定具有操作簡單、成本低、結果相對可靠、重復性好等優(yōu)點，因此應用較廣泛。

1.3 新興菌相分析技術

優(yōu)勢腐敗菌在初始菌相中含量一般較少，利用傳統(tǒng)分離培養(yǎng)的方法往往很難檢出[25]（＜102cfu·g-1），新興的菌相分析技術能夠檢出非培養(yǎng)微生物并克服傳統(tǒng)方法檢測限低的難題，于是分子診斷技術逐漸被用于SSO的鑒定。目前應用的新興菌相分析技術主要有：DNA指紋技術中的聚合酶鏈式反應—變性梯度凝膠電泳（PCR-DGGE）、以生化理論為基礎的微生物鑒定系統(tǒng)的應用和宏基因組學技術等。

1.3.1 PCR-DGGE技術

DGGE是根據DNA片段熔解性質的不同使其分離。以混合微生物的總DNA為模板進行擴增得到不同的DNA片段，經變性梯度凝膠電泳可以得到亮度差異的條帶，對條帶進行回收測序即可得到樣品中微生物信息。目前PCR-DGGE技術在菌相分析鑒定方面已趨于成熟。起初PCR-DGGE技術主要應用到土壤中菌相分析研究，如Ma等[26]應用PCR-DGGE技術分析灌木的根系真菌，通過和土壤中菌群比對，發(fā)現了一株新的根系真菌。受此啟發(fā)，后來該技術逐漸被用于肉制品中的菌相研究：胡萍等[19]利用16S rRNA結合DGGE技術研究了真空包裝的切片火腿在4℃儲藏條件下的主要腐敗菌，最終成功確定優(yōu)勢腐敗菌是清酒乳桿菌和彎曲乳桿菌；潘康成等[27]利用PCR-DGGE技術研究了肉雞中腸道菌群的多樣性。PCR-DGGE技術能夠有效地、全面地分析生物圈內微生態(tài)的結構和功能，很好地指導人們認識微生物世界，更加有效地調控微生物的消長，進而有針對性地控制食品的腐敗變質。將PCR-DGGE技術和其他分析技術進行綜合分析菌相是總的發(fā)展趨勢。

1.3.2 微生物鑒定系統(tǒng)

隨著引起食物腐敗變質微生物的不斷增加，傳統(tǒng)的利用單個試驗鑒定微生物已不能滿足需求，擁有巨大資料庫的微生物鑒定系統(tǒng)逐漸取代傳統(tǒng)鑒定方法。目前市場上以生化理論為基礎的微生物鑒定系統(tǒng)平臺產品主要有法國的手工API、半自動的ATB及全自動的 Vitek2Compact鑒定系統(tǒng)[28]，美國的Biolog和Phoenix100鑒定系統(tǒng)。目前國內在微生物鑒定中用到的鑒定系統(tǒng)主要是API和Biolog。API鑒定系統(tǒng)是以微生物生化理論為基礎，借助微生物信息編碼技術，為微生物檢驗提供了簡易、快捷、科學的鑒定程序，是一種全球金標準，涵蓋了美國FDA的細菌鑒定標準、歐洲藥典的細菌鑒定標準以及中國的GB 4789的內容。API鑒定系統(tǒng)具有系統(tǒng)化、操作簡易和快速報道的優(yōu)點，經過近30年的積累，擁有的菌種資料超過25 000種，相關的應用文獻已超過1 500篇。國內近幾年API鑒定系統(tǒng)在菌相分析上研究報道較多，如陳偉勝等[29]利用API鑒定系統(tǒng)研究了藥品的微生物污染鑒定和溯源分析，戴小波等[30]將API和DL-96鑒定系統(tǒng)分析室間質控菌相結果進行對比，其中API得到的數據庫比DL-96大，并且兩者的準確率相近，姜英杰[31]對初步鑒定為腸桿菌的菌株，進行API 20E鑒定，并成功鑒定大腸桿菌[32]。法國梅里埃開發(fā)的鑒定系統(tǒng)平臺具有廣泛的認可性，但是目前國內的API鑒定系統(tǒng)主要集中在醫(yī)學領域，有關食品中微生物菌相的研究應用鮮有報道，將API鑒定系統(tǒng)應用到低溫肉制品貨架期的預測研究具有研究意義。

Biolog鑒定系統(tǒng)是基于微生物利用的碳源或化學敏感物質進行鑒定的，由于該系統(tǒng)并非以經典的伯杰式細菌鑒定手冊為基礎建立的，所以在業(yè)界內頗具爭議。Biolog鑒定系統(tǒng)一般和其他鑒定方法進行綜合分析，因其要求專業(yè)化的操作人員，所以主要用于科研用途。如邢華銘等[33]利用PCR-DGGE和 Biolog技術比較土壤微生物多樣性，其中Biolog得到的數據不穩(wěn)定、反應的信息量和敏感度不及PCRDGGE技術，所以Biolog在菌相研究中應用較少，主要集中在有關碳源代謝機理方面的研究。

1.3.3 宏基因組學技術

1988年Handelsman等最初提出來的新名詞宏基因組（metagenome）是指生物環(huán)境中全部微小生物遺傳物質的總和[34]。其研究對象是環(huán)境樣品中細菌界和真菌界基因組總和。宏基因組學[35]（metagenomics）是一種新的研究宏基因組的方法，一般包括宏基因組文庫的構建以及文庫的篩選兩部分研究內容，其中文庫的構建是主體一般需要進行DNA的提取、克隆DNA到合適的載體、導入合適宿主細胞，篩選目的轉化子等工作。宏基因組學最主要的應用是研究微生物群落結構及其功能。目前新興的宏基因組學技術在海洋、土壤、農業(yè)、醫(yī)學、新能源、環(huán)境保護和污染修復的研究等方面得到了廣泛應用，隨著宏基因組技術的成熟，國內陸續(xù)有研究者將宏基因組學技術應用到食品中的菌相分析的研究中，如醋醅中的菌相分析[36]和大曲酒中的菌相分析等[37]。雖然新興的宏基因組學技術檢出限低、穩(wěn)定性好，但是目前最大的障礙是肉制品中動物基因組的干擾，所以目前并未應用到肉制品中的菌相分析再加上檢測成本高。

隨著微生物世界認識的不斷深入以及微生物的自身進化變異，菌相分析對以16SRNA為基礎的分子生物學新技術和產品化的微生物鑒定平臺提出了更高的要求。分子生物學新技術由原先的保守區(qū)段發(fā)展到全基因組比對，隨著Maldi-TOF（基質輔助激光解析飛行時間質譜儀）在蛋白質分析上的成熟，科學家們著眼于細菌核質體蛋白分析來鑒定菌株，細菌快速鑒定飛行質譜法是未來食品安全檢測的發(fā)展趨勢[38]。Maldi-TOF將會使低溫肉制品特定腐敗菌的確定更加趨于快速、準確，從而更加有效地監(jiān)控食品腐敗，為低溫肉制品的貨架期預測提供基礎。

2 微生物生長模型研究概況

在菌相分析研究得到SSO豐度的基礎上，國內外研究者建立了微生物的生長模型，根據變量的類型可將模型分為一級模型、二級（次級）模型和三級模型，初級模型反映的是微生物生長的對數和時間的關系，通過一級模型可以推斷出SSO的初始菌數、遲滯期以及最大生長濃度等特征值；二級模型反映的是一級模型中的特征值受各種環(huán)境參數的變化情況；三級模型主要是將一級、二級模型結合起來，開發(fā)出來的可以直接面向用戶的軟件系統(tǒng)。

初級模型主要有Gompertz函數、Richard方程、Logistic方程、Schnute方程、Baranyi模型、Stannard方程等[39-40]。其中修正的Gompertz方程能夠有效地描述微生物的生長，修正的Gompertz方程表達式如下：

lgN（t）=lgN0+lg（Nmax/N0）×exp{-exp[2.718μmax/lg（Nmax/N0）×（Lag-t）+1]}

式中：t為時間（d），N（t）為t時的菌數（cfu·g-1），Nmax、N0為最大和初始菌數（cfu·g-1），μmax為微生物生長的最大比生長速率（d-1），Lag為微生物生長的延滯時間（d）。

在一級模型建立的基礎上，建立起來的二級模型主要有Arrhennius模型、Belehradek平方根模型[41-42]、概率模型和響應面模型[36]等。次級模型中Belehradek平方根模型是基于微生物生長速率的平方根與溫度之間的線性關系[43]，是Ratkowsk等根據微生物在不同溫度條件下，生長速率或遲滯期倒數的平方根與溫度之間存在的線性關系提出的經驗模型。在食品中特定腐敗菌生長動力學研究中被廣泛地應用。Belehradek方程如下所示：

式中Tmin是一個假設的概念，指的是在此溫度條件下微生物的代謝活動為0。

隨著科學技術的更新發(fā)展，國外對食品貨架期預測的研究，除了利用數學模型來預測食品的貨架期外，更多的趨向于借助計算機來進行簡便、快速地預測。在初級和次級模型的基礎上建立起來的三級模型（應用軟件），能夠有效地反映在既定的環(huán)境條件下微生物的數量和環(huán)境之間的關系。

1983年開發(fā)的腐敗菌生長數據庫，拉開了預測微生物學的序幕。研究者和資金的大量投入，使得預測微生物學蓬勃發(fā)展。目前國外建立的預測模型有美國農業(yè)部開發(fā)的PMP（病原菌模型）、加拿大的MKES、英國的FMM[44]，新西蘭的TFI（溫度函數積分模型）[45]和ComBase等軟件，并且這些軟件基本上都已經相當成熟。PMP是預測微生物學中比較簡單的學習方法，研究的對象主要是一些病原菌，將病原菌的所處條件即食品的加工品質特性輸入，便可得到病原菌的生長數據；其中Combase在線預測軟件能夠很好地預測某些特定產品的貨架期。

與國外相比，國內的微生物預測技術起步相對較晚。目前國內建立的預測軟件主要有中國水產研究所開發(fā)的FLSP（Fish Shelf Life Predictor），姜英杰建立的大腸桿菌和假單胞菌在冷卻豬肉中的預測軟件來預測豬肉的貨架期[31]。但是這些軟件都比較簡單，涵蓋和涉及到的SSO的范圍比較局限。因此，開發(fā)出適應低溫肉制品所處復雜條件的貨架期預測軟件，有待進一步探索研究，并對其進行驗證和改良的必要。

3 模型的驗證和改良

在國外成熟預測技術的基礎上，尤其是那些可以進行在線預測的軟件，一方面可以很好的引導國內研究者對低溫肉制品預測軟件的開發(fā)，另一方面也可對建立的預測軟件進行驗證。然而對建立的一級模型和二級模型的有效性進行評價，一般將模型的預測值和實驗的實測值相比較，采用偏差因子（Bias factor，Bf）和準確因子（Accuracy factor，Af）來進行評價所建立模型的可靠性。Bf和Af并不能作為評判所建立模型的唯一指標，因為它們不能描述系統(tǒng)偏差，而采用預測值和觀察值的直觀對比圖能夠揭示系統(tǒng)偏差，所以在評判模型時進行兩者的綜合評判。Af和Bf如下式所示：

式中，Nobs是試驗實際測得的菌落數，Npve是應用生長動力學模型預測得到的與Nobs同一時間的菌落數，n表示試驗的次數。

針對前面建立的模型和預測軟件進行驗證，如果模型和軟件的誤差過大，則需要對其進行重新建模；如果模型的誤差在可接受的范圍內，將對建立的模型進行改良，使其預測的貨架期的誤差盡量最小。

4 貨架期預測技術的意義及展望

低溫肉制品貨架期預測技術的研究使得肉類生產企業(yè)合理規(guī)劃生產，有效地避免損失。隨著越來越多的新興技術和新理論引入貨架期預測，今后PCRDGGE技術、全自動的微生物鑒定系統(tǒng)及宏基因組學等技術將會應用到低溫肉制品的菌相分析研究；隨著低溫肉制品的微生物生長數據庫的不斷豐富，將會開發(fā)出越來越多的適合低溫肉制品的預測軟件，更加準確地預測低溫肉制品的貨架期。

［1］孫然然.乳酸菌及其代謝產物對低溫切片火腿生物防腐作用的研究［D］.石河子：石河子大學，2013.

［2］David K，Persis S.The stability and shelf-life of food［J］.Food Trade Review，2002，72（9）：541-541.

［3］李除夕.豆腐特定腐敗菌研究及貨架期預測模型建立［D］.南京：南京農業(yè)大學，2008.

［4］Huisintveld J H.Microbial and biochemical spoilage of foods：an overview［J］.International Journal of Food Microbiology，2006，33（1）：1-18.

［5］Thomas A，Meekin M，Thomas R.Shelf life prediction：status and future possibilities［J］.International Journal of Food Microbiology，2006，33（1）：65-83.

［6］Christison C A D，Lindsay D，Holy von A.Microbiological survey of ready-to-eat foods and associated preparation surfaces in retail delicatessens，Johannesburg，South Africa［J］.Food Control，2008，19（7）：127-733.

［7］Naknean，Phisut.Improvement in Shelf Life and Safety of Pasteurized Palm Sap（Borassus flabellifer Linn.）by the Addition of Nisin［J］.Journal of Food Safety，2013，33（4）：515-525.

［8］胡萍.真空包裝煙熏火腿切片特定腐敗菌及靶向抑制研究［D］.南京：南京農業(yè)大學，2008.

［9］Blixt Y，Borch E.Comparison of shelf life of vacuumpacked pork and beef［J］.Meat Science，2002，60（4）：371-378.

［10］Borch E，KantMuemans M L，Blixt Y.Bacterial Spoilage of meat Products and cured meat products［J］.International Journal of Food Microbiology，1996，33（1）：103-120.

［11］Liu F，Yang R Q，Li Y F.Correlations between growth parameters of spoilage microorganisms and shelf-life of pork stored under air and modified atmosphere at-2，4 and 10℃［J］.Food Microbiology，2006，23（6）：578-583.

［12］李琳，潘子強.水產品特定腐敗菌的確定及生長模型建立研究進展［J］.食品研究與開發(fā)，2011，32（6）：152-156.

［13］Chris Bell.The Microbiological Safety and Quality of Food Volumes I and II［J］.International Food Safety News，2000，9（7-8）：12-13.

［14］Samelis J，Georgiadou K G.Themicrobial association of Greek taverna sausage stored at 4 and 10℃ in air，vacuum or 100% carbon dioxide，and its spoilage potential［J］.Journal of Applied Microbiology，2000，88（1）：58-68.

［15］Chenoll E，Macian M C，Elizaquivel P，et al.Lactic acid bacteria associated with vacuum-packed cooked meat product spoilage：population analysis by rDNA-based methods［J］.Journal of Applied Microbiology，2007，102（1）：498-508.

［16］Samelis J，Kakouril A，Remenltzis J.Evaluation of the extent and type of bacterial contamination at different stages of processing of cooked ham［J］.Journal of Applied Microbiology，2000，84（4）：649-660.

［17］Korkeala H J，Bjorkroth K J.Microbiological spoilage and contamination of vacuum-packaged cooked sausages［J］.Journal of Food Protection，1997，60（6）：724-731.

［18］Olga S，Papadopoulou，Efstathios Z，et al.Sensory and microbiological quality assessment of beef fillets using a portable electronic nose in tandem with support vector machine analysis［J］.Food Research International，2013，50：241-249.

［19］吳偉偉.生豬屠宰過程中小腸結腸炎耶爾森氏菌的調查研究及預測模型研究［D］.南京：南京農業(yè)大學，2007.

［20］李苗云.冷卻豬肉中微生物生態(tài)分析及貨架期預測模型的研究［D］.南京：南京農業(yè)大學，2006.

［21］王寧.冷卻羊肉腐敗菌菌相變化及其控制技術研究［D］.武漢：華中農業(yè)大學，2007.

［22］全拓.肉制品中主要微生物的檢測與研究［D］.重慶：西南大學，2012.

［23］Andrase T，Rudiger P，Drik B，et al.Influence of Myristoylation，Phosphorylation，and Deamidation on the Structural Behavior of the N-Terminus of the Catalytic Subunit of CAMP-Dependent Protein Kinas［J］.Biochemistry，2001，40（1）：225-231.

［24］金鑫.熱鮮豬肉食用品質及其特定腐敗菌預測模型的研究［D］.南京：南京農業(yè)大學，2012.

［25］胡萍，徐興蓮.Lactobacillus sakei對真空包裝切片火腿的特定腐敗菌研究［J］.肉類工業(yè)，2010（8）：19-24.

［26］MaW K，Siciliano SD，Germida JJ.PCR-DGGEmethod for detecting arbuscular mycorrhizal fungi in cultivated soils［J］.Soil Biology and Biochemistry，2005，37（9）：1589-1597.

［27］潘康成，陳正禮，崔恒敏，等.利用ERIC-PCR和PCRDGGE技術分析喂服枯草芽孢桿菌肉雞腸道菌群的多樣性［J］.動物營養(yǎng)學報，2010，22（4）：985-991.

［28］李蕾蕾，任怡然，王素英.蝦蛄在低溫貯藏過程中的細菌菌相分析［J］.食品工業(yè)科技，2013，34（18）：331-335.

［29］陳偉盛，關倩明，朱榮峰，等.藥品微生物限度檢查中微生物污染的鑒定和溯源分析［J］.藥物分析雜志，2014（1）：58-63.

［30］戴小波，曾朱君，許堅鋒，等.API與DL-96微生物鑒定系統(tǒng)在鑒定室間質控菌株中的對比研究［J］.國際檢驗醫(yī)學雜志，2013，34（11）：1437-1439.

［31］姜英杰.假單胞菌和大腸桿菌在冷卻豬肉中生長預測模型的建立［D］.南京：南京農業(yè)大學，2008.

［32］Gospvic R，Kreyenschmidt J，Brucken S，et al.Mathematicalmodelling for predicting the growth of Pseudomonas spp.in poultry under variable temperature conditions［J］.International Journal of Food Microbiology，2008，127（3）：290-297.

［33］刑華銘，杜海濤，張黎黎，等.PCR-DGGE與Biolog技術在土壤微生物多樣性研究中的比較［J］.農業(yè)開發(fā)與裝備，2013，10：48-49.

［34］Handelsman J，Rondon M R，Brady S F，et al.Molecular biological accesses to the chemistry of unknown soil microbes：A new frontier for natural products［J］.Chemistry Biology，1988（10）：245-249.

［35］Henne A，Daniel R，Schmitz RA，et al.Construction of environmental DNA libraries in Escherichia coli and screening for the presence of genes conferring utilization of 4-hydroxybutyrate［J］.Applied and Environmental Microbiology，1999，65：3901-3907.

［36］聶志強，韓玥，鄭宇，等.宏基因組學技術分析傳統(tǒng)食醋發(fā)酵過程微生物多樣性［J］.食品科學，2013，34（15）：198-203.

［37］黃祖新.宏基因組學及其在大曲酒微生物研究中的應用［J］.釀酒科技，2009（10）：17-21.

［38］孫大慶，王穎，張東杰.抗微生物藥物殘留檢測方法研究新進展［J］.黑龍江八一農墾大學學報，2014，26（1）：50-54.

［39］Laurence M，Derlinden E V，Jan FV.Comparing experimental design schemes in predictive food microbiology：Optimal parameter estimation of secondary models［J］.Journal of Food Engineering，2012，112（3）：119-133.

［40］Anat Bren，Yuval Hart.The last generation of bacterial growth in limiting nutrient［J］.BMC System Biology，2013，7（1）：1-9.

［41］Zwietering M H，Rombouts F M.Some aspects of modeling microbial quality of food［J］.Food Control，1993，4（2）：89-96.

［42］Ratkowsky D A，Lowry R K.Model for bacterial culture growth rate throughout the entire biokinetic temperature range［J］.Journal of Bacteriology，1983，154（3）：1222-1226.

［43］Davey K R.Applicability of the davey linear Arrhenius predictivemodel to the lag phase ofmicrobial growth［J］.Journal of Application Bacteriology，1991，70（3）：253-257.

［44］劉偉，劉衛(wèi)東，應華清.預測微生物學及其在食品安全領域的應用［J］.中國預防醫(yī)學雜志，2007，8（4）：511-512.

［45］Neil H A.Use of Predictivemicrobiology inmeat hygiene regulatory activity［J］.International Journal of Food Microbiology，1997，36（2）：103-109.