王軍寧，郭維娟，杜 虹，于海濤，蔣 偉，白雪帆，王平忠

腎綜合征出血熱（hemorrhagic feverwith renal syndrome,HFRS）是由漢坦病毒引起的以發(fā)熱、出血、PLT減少及不同程度腎損傷為臨床特征的急性傳染病[1]。典型病例有5期臨床經(jīng)過(guò)，分別為發(fā)熱期、低血壓休克期、少尿期、多尿期和恢復(fù)期。根據(jù)疾病的嚴(yán)重程度，可分為輕型、中型、重型和危重型。本病的基本病理變化是全身廣泛性毛細(xì)血管損傷及通透性增加，但其具體致病機(jī)制至今尚未闡明。已有大量研究證實(shí)機(jī)體的固有免疫及適應(yīng)性免疫在HFRS發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮了重要作用，腫瘤壞死因子（tumour necrosis factor,TNF）-α、白細(xì)胞介素（interleukin,IL）-6、IL-4、IL-8和干擾素（interferon,IFN）γ等細(xì)胞因子在HFRS發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用[2-3]。IL-18是一種促炎癥細(xì)胞因子，與機(jī)體多種炎癥反應(yīng)密切相關(guān)[4-5]，但I(xiàn)L-18在HFRS患者不同病期和臨床型中的動(dòng)態(tài)變化尚未見(jiàn)報(bào)道。為了探討IL-18在HFRS發(fā)病中的作用，我們檢測(cè)了不同病期及不同臨床型HFRS患者血漿IL－18水平變化，并進(jìn)一步探討其與病程及病情的相關(guān)性，以期為HFRS發(fā)病機(jī)制研究提供依據(jù)。

1 對(duì)象與方法

1.1 對(duì)象 選取第四軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院2011年10月—2014年1月收治的81例HFRS患者不同病期血樣145份。所有患者經(jīng)血清學(xué)檢查HFRS特異性IgG和IgM陽(yáng)性而確診，并排除合并其他病毒性感染、腎臟疾病、自身免疫相關(guān)性疾病及腫瘤性疾病，治療期間未用激素及其他免疫抑制劑。另選取15名來(lái)自本科室的志愿者為健康對(duì)照。共收集患者輕型12例，中型21例，重型25例，危重型23例。以及收集發(fā)熱/低血壓期血樣40份，少尿期血樣35份，多尿期血樣49份，恢復(fù)期血樣21份。根據(jù)疾病過(guò)程特點(diǎn)，把發(fā)熱/低血壓期和少尿期歸為急性期，把多尿期和恢復(fù)期歸為恢復(fù)期[6]。本項(xiàng)研究通過(guò)第四軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院倫理委員會(huì)審批同意，所有患者都簽署知情同意書。

1.2 研究方法 無(wú)菌采集患者3ml靜脈血，1500 r/min離心10min，收集血漿并分裝，－80℃保存。采用購(gòu)買于美國(guó)R&D公司的ELISA試劑盒測(cè)定血漿中的IL－18水平，實(shí)驗(yàn)操作嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行，每個(gè)樣本做2個(gè)復(fù)孔，取平均值。同時(shí)登記采血當(dāng)天患者的 WBC、PLT、BUN、CRE（由本院檢驗(yàn)科檢測(cè)）。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 用SPSS 17.0軟件和GraphPad Prism 5軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料呈非正態(tài)分布，用中位數(shù)表示，多組間比較用Kruskal－Wallis H檢驗(yàn)比較總體差異，用Nemenyi秩和檢驗(yàn)進(jìn)行兩兩比較。急性期輕型/中型組與重型/危重型組IL－18水平呈正態(tài)分布且組間方差齊，2組比較用成組t檢驗(yàn)。IL－18與其他檢測(cè)指標(biāo)的相關(guān)性分析用Spearman相關(guān)分析。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 患者4個(gè)病期IL－18水平變化 患者IL－18水平的中位數(shù)在發(fā)熱/低血壓期、少尿期、多尿期、恢復(fù)期和正常對(duì)照值分別為 811、1008、581、485、167 pg/ml。其中發(fā)熱/低血壓期、少尿期、多尿期及恢復(fù)期IL－18水平均高于正常對(duì)照值（P均＜0.05）。發(fā)熱/低血壓期與少尿期IL－18水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但此2期均高于多尿期和恢復(fù)期（P均＜0.05）；多尿期與恢復(fù)期IL－18水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。說(shuō)明患者IL－18水平在發(fā)熱/低血壓期和少尿期上升到最高水平，到多尿期和恢復(fù)期明顯下降，但是仍然高于正常對(duì)照值。見(jiàn)圖1。

圖1 81例4個(gè)病期血漿IL-18水平變化發(fā)熱/低血壓期、少尿期、多尿期、恢復(fù)期及正常對(duì)照的樣本量分別為 40、35、49、21和 15；5組比較用 Kruskal－Wallis H 檢驗(yàn)，H=70.990，P=0.000，組間多重比較用 Nemenyi秩和檢驗(yàn)；*P＜0.05，**P＜0.001Figure 1 Changes of p lasma IL-18 level in 81 HFRS patients at 4 phases

2.2 急性期和恢復(fù)期IL－18水平變化 將4個(gè)病期合并為急性期和恢復(fù)期2個(gè)病期，發(fā)現(xiàn)血漿IL－18水平在急性期和恢復(fù)期均高于正常對(duì)照值（P均＜0.05），并且急性期高于恢復(fù)期（P＜0.05）。說(shuō)明患者IL－18水平在急性期處于最高水平，到恢復(fù)期明顯下降，但是仍然未降到正常值范圍。見(jiàn)圖2。

圖2 患者急性期和恢復(fù)期IL-18水平變化3 組比較用 Kruskal－Wallis H檢驗(yàn)，H=58.220，P=0.000，組間多重比較用Nemenyi秩和檢驗(yàn)，***P＜0.001Figure 2 Changes of IL-18 level in patients at acute and convalescent phases

2.3 4種臨床型患者在急性期和恢復(fù)期IL－18水平變化 4種臨床型患者IL－18水平在急性期和恢復(fù)期均高于正常值（P均＜0.05），輕型患者急性期與恢復(fù)期比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)意義（P＞0.05），而中型、重型和危重型患者急性期均高于恢復(fù)期（P均＜0.05）。見(jiàn)圖3。

圖3 4種臨床型患者急性期和恢復(fù)期IL-18水平變化A.輕型；B.中型；C.重型；D.危重型。3 組比較用 Kruskal－Wallis H 檢驗(yàn)，A，H=23.980，P=0.000；B，H=39.800，P=0.000；C，H=40.040，P=0.000；D，H=38.190，P=0.000。組間多重比較用 Nemenyi秩和檢驗(yàn)，*P＜0.05；**P＜0.01；***P＜0.001Figure 3 Changes of IL-18 level in 4 clinical types of HFRS patients at acute and convalescent phases

2.4 患者急性期IL－18水平變化 將75例急性期4種臨床型合并為重型/危重型和輕型/中型，發(fā)現(xiàn)在急性期，重型/危重型IL－18水平較輕型/中型升高更為明顯（P＜0.05）。32例輕型/中型患者中僅有5例（15.6%）IL－18水平超過(guò)1000 pg/ml，然而43例重型/危重型患者中有22例（51.5%）超過(guò)1000 pg/ml，超過(guò)率是輕型/中型的3.3倍。見(jiàn)圖4。

圖4 急性期患者IL-18水平在輕型/中型組與重型/危重型組的比較2組之間比較用成組t檢驗(yàn)，t=3.527，**P＜0.010Figure 4 Changes of IL-18 level in HFRS patients at acute phase between them ild/moderate group and the severe/critical group

2.5 IL－18與其他檢測(cè)指標(biāo)相關(guān)性分析 患者IL－18水平與反映疾病進(jìn)程和嚴(yán)重程度的指標(biāo)WBC和BUN呈中等正相關(guān)（圖5A、5C），與CRE呈弱正相關(guān)（圖5D），與PLT呈中等負(fù)相關(guān)（圖5B）。見(jiàn)圖5。

圖5 患者血漿IL-18與WBC、PLT、BUN和CRE的相關(guān)性Figure 5 Correlations between plasma IL-18 level and WBC,PLT,BUN and CRE

3 討 論

HFRS是由漢坦病毒感染引起的一種人獸共患傳染病，主要臨床表現(xiàn)為發(fā)熱、低血壓休克、PLT減少、出血和腎損傷。血管內(nèi)皮細(xì)胞是病毒感染的主要靶細(xì)胞[1]?？梢鹑硇⊙芎兔?xì)血管的廣泛性損傷，其基本病理改變?yōu)檠獫{外滲。近年發(fā)現(xiàn)，漢坦病毒可通過(guò)β3－整合素受體破壞血管內(nèi)皮細(xì)胞間緊密連接，使鈣黏蛋白內(nèi)化分解，從而增強(qiáng)血管內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子的敏感性，使血管通透性增加[7－8]。但是單獨(dú)血管內(nèi)皮緊密連接的損傷也難以解釋病毒感染后的血管通透性升高。目前普遍的觀點(diǎn)認(rèn)為，HFRS的發(fā)病機(jī)制可能是多因素共同作用的結(jié)果。其中漢坦病毒感染后免疫介導(dǎo)的病理?yè)p傷是主要的誘導(dǎo)因素。體內(nèi)外研究均表明漢坦病毒感染可誘導(dǎo)炎癥細(xì)胞因子/趨化因子的高水平表達(dá)[1－2]，它們?cè)贖FRS發(fā)病機(jī)制中可能發(fā)揮了重要作用。

IL－18 屬 IL－1 超家族成員[9]，是 Okamura等[10]于1995年從滅活的丙酸桿菌致敏后注射脂多糖的裸鼠肝細(xì)胞中分離并克隆出來(lái)的一種細(xì)胞因子，是主要由單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的一種多生物活性的前炎性細(xì)胞因子，可誘導(dǎo)急性期炎性反應(yīng)的產(chǎn)生，促進(jìn)多種免疫細(xì)胞的分化及活化,同時(shí)可誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞產(chǎn)生IFNγ，對(duì)固有免疫及適應(yīng)性免疫均有調(diào)節(jié)作用。其作用已在糖尿病、多發(fā)性硬化癥、神經(jīng)性皮炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、銀屑病等自身免疫性疾病、敗血癥及AIDS等感染性疾病發(fā)病機(jī)制研究中有所報(bào)道[9，11-12]。

HFRS患者細(xì)胞因子/趨化因子的變化及與疾病嚴(yán)重程度的關(guān)系有諸多報(bào)道。Saksida等[13]研究發(fā)現(xiàn)血漿IL-10、IFNγ和TNF-α幾乎在所有HFRS早期都升高，重癥患者IL-10和TNF-α與正常對(duì)照值比較也明顯升高。這表明促炎癥因子和調(diào)節(jié)性細(xì)胞因子的失衡在HFRS發(fā)病中起著重要作用。

本研究檢測(cè)了 HFRS 患者 TNF-α、IL-6、IL-4、IL-8、IFN γ 和 IP-10 水平[2]，發(fā)現(xiàn)血漿 TNF-α、IL-6、IFNγ、IL-8和IP-10濃度與正常對(duì)照值相比明顯升高，最高濃度峰一般在發(fā)熱期、低血壓期及少尿期，并與疾病嚴(yán)重程度相一致。這表明漢坦病毒感染產(chǎn)生大量炎癥因子，導(dǎo)致超強(qiáng)免疫反應(yīng)，在疾病早期可能引起“細(xì)胞因子風(fēng)暴”，在調(diào)節(jié)免疫和清除病毒的同時(shí)，導(dǎo)致免疫損傷。

我們的研究表明，HFRS患者血漿IL-18水平在發(fā)熱期開始升高，在少尿期達(dá)峰值，同時(shí)腎損傷也是開始于發(fā)熱期，少尿期損傷最為嚴(yán)重。當(dāng)進(jìn)入多尿期，隨著尿量的增加，腎功能逐漸恢復(fù)正常，IL-18水平開始下降。恢復(fù)期IL-18水平與正常對(duì)照相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，此期患者的腎功能也恢復(fù)正常。相關(guān)分析還發(fā)現(xiàn)HFRS患者血漿IL-18水平與BUN、CRE呈中等程度正相關(guān)，BUN和CRE是腎損傷程度的主要標(biāo)志，這些結(jié)果表明HFRS患者血漿IL-18在一定程度上反映了疾病的嚴(yán)重程度。已有研究表明血漿IL-18水平可預(yù)測(cè)肝移植后急性腎損傷，與糖尿病腎病密切相關(guān)，還可預(yù)測(cè)危重型患者急性腎損傷腎臟替代治療的短期預(yù)后[14-17]。

HFRS病毒血癥是短暫的，在發(fā)熱期末漢坦病毒基本被機(jī)體清除[18]。血漿IL-18在發(fā)熱期開始升高，少尿期達(dá)最高峰，并與疾病嚴(yán)重程度密切相關(guān)。這表明血漿IL-18在清除漢坦病毒方面的作用非常微弱，主要是通過(guò)炎癥介質(zhì)介導(dǎo)的免疫反應(yīng)參與HFRS的病理過(guò)程。IL-18可刺激T淋巴細(xì)胞的增殖，促進(jìn)輔助性T細(xì)胞免疫應(yīng)答，誘導(dǎo)IFNγ產(chǎn)生，增強(qiáng)FasL介導(dǎo)的細(xì)胞毒效應(yīng)，另一方面IL-18直接作用于自然殺傷細(xì)胞，增強(qiáng)其自然殺傷活性[19]，從而在HFRS的發(fā)病過(guò)程中起了重要作用。

本研究發(fā)現(xiàn)IL-18水平不僅與疾病進(jìn)程有關(guān)，而且重型/危重型患者在急性期明顯高于輕型/中型，同時(shí)血漿IL-18水平與WBC和PLT水平密切相關(guān)。WBC也是機(jī)體固有免疫充分活化的標(biāo)志，PLT與疾病嚴(yán)重程度密切相關(guān)，并可預(yù)測(cè)急性腎損傷[20]。這表明IL-18血漿濃度與疾病嚴(yán)重程度密切相關(guān)。

綜上所述，IL-18在HFRS急性期明顯升高，在不同病期和臨床型之間有明顯變化，并且與反映疾病嚴(yán)重程度的臨床指標(biāo)密切相關(guān)。因此，IL-18可用作臨床判斷病情變化的一個(gè)參考指標(biāo)。此外，如果在HFRS早期阻斷IL-18的分泌，或者干預(yù)IL-18與其受體結(jié)合，可能會(huì)減輕疾病的嚴(yán)重程度、縮短病程，為HFRS的治療提供更多的措施。但是IL-18在HFRS中的致病機(jī)制尚不明確，還有待進(jìn)一步研究。

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