楊青，石有斐，陳靜，王苗利，徐鴻，王貴升

(1.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院, 山東泰安271018；2.山東省動物疫病預(yù)防與控制中心, 山東濟(jì)南250022)

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貂源大腸桿菌的分離鑒定及耐藥性研究

楊青1，石有斐1，陳靜2，王苗利2，徐鴻2，王貴升2

(1.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院, 山東泰安271018；2.山東省動物疫病預(yù)防與控制中心, 山東濟(jì)南250022)

為了初步探究山東省貂源大腸桿菌耐藥性及耐藥基因情況，對30日病死貂腦組織分離得到的大腸桿菌進(jìn)行O抗血清型鑒定、藥敏試驗(yàn)及耐藥基因檢測。結(jié)果顯示，該分離菌血清型為O114，且對多種藥物產(chǎn)生耐藥，并攜帶至少3種耐藥基因。試驗(yàn)所分離的貂源大腸桿菌能夠穿過血腦屏障，耐藥性嚴(yán)重且存在交叉耐藥現(xiàn)象。

大腸桿菌；分離鑒定；血腦屏障；耐藥基因

大腸桿菌(Escherichiacoli)，又被稱為大腸埃希氏菌，是腸桿菌科、埃希氏菌屬的代表菌[1]。致病性大腸桿菌給山東省畜牧業(yè)帶來了一定危害，以水貂養(yǎng)殖為例，水貂大腸桿菌病以斷乳前后的仔貂發(fā)生最多，潛伏期2～5 d，一旦發(fā)病，短時(shí)間內(nèi)即可導(dǎo)致病貂死亡，該病的爆發(fā)和流行，嚴(yán)重威脅我國養(yǎng)貂業(yè)的發(fā)展[2]。為了防治水貂大腸桿菌病，抗生素類藥物的長期、不合理的使用導(dǎo)致耐藥菌株不斷出現(xiàn)，并呈現(xiàn)出高水平耐藥、多重耐藥和交叉耐藥的嚴(yán)重發(fā)展態(tài)勢[3]。血腦屏障是在腦和脊髓內(nèi)的毛細(xì)血管與神經(jīng)組織之間存在的一個(gè)調(diào)節(jié)界面，血腦屏障不單純是被動保護(hù)性屏障，還可以選擇性的將腦內(nèi)有害或過剩物質(zhì)泵出腦外，保持腦的內(nèi)環(huán)境恒定[4]。目前，水貂腦組織中分離得到的大腸桿菌的耐藥情況還不清楚，本文從耐藥性等方面探究穿過血腦屏障的大腸桿菌的相關(guān)生物學(xué)特性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料 來自山東省濰坊市某大型貂場的30 日齡病死雛貂27 只。無菌取病死貂的腦組織，編號、待檢。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動物 20～30 g昆明小鼠由山東大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供。

1.1.3 培養(yǎng)基及主要試劑 沙門氏菌顯色培養(yǎng)基、尿路菌群顯色培養(yǎng)基，上海欣中生物工程有限公司；LB培養(yǎng)基、麥康凱培養(yǎng)基、普通肉湯培養(yǎng)基、瓊脂糖凝膠，北京路橋技術(shù)有限公司； 大腸埃希氏O抗原定型血清，中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所； PCR反應(yīng)液、雙蒸水、DNA Marker DL2000，寶生物工程(大連)有限公司。

1.1.4 主要設(shè)備 VITEK 2 生化藥敏鑒定系統(tǒng)及配套比濁儀，生化、藥敏實(shí)驗(yàn)卡，法國梅里埃公司；ALS-1296 PCR儀，美國BIO-RAD ；BDA-BOX2紫外凝膠成像系統(tǒng)，BIOMETRA；微量移液器，德國艾本德(中國)有限公司；MIR-253-20 ℃超低溫冰箱，日本三洋株式會社；奧林巴斯BX-43顯微鏡，日本奧林巴斯株式會社。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌的分離培養(yǎng)與形態(tài)觀察 參照文獻(xiàn)方法[5]，取無菌采集的病死貂的腦組織，劃線接種于沙門氏菌顯色培養(yǎng)基和尿路菌群顯色培養(yǎng)基，于37 ℃培養(yǎng)12 h，觀察菌落的生長情況及菌落的形態(tài)，并用接種環(huán)無菌挑取單個(gè)生長良好的菌落，按常規(guī)方法涂片，進(jìn)行革蘭氏染色，并觀察菌體大小和形態(tài)。從沙門氏菌顯色培養(yǎng)基挑取疑似大腸埃希菌的菌落接種于麥康凱培養(yǎng)基，于37 ℃培養(yǎng)12 h，觀察菌落的大小、形態(tài)和顏色。

1.2.2 生化試驗(yàn) 按VITEK2 生化藥敏鑒定儀的說明，將3 mL無菌鹽水加入到清潔塑料管中，以無菌棉拭子挑取麥康凱瓊脂平板上形態(tài)相同的菌落至鹽水管中，混勻，用已校正的VITEK2比濁儀調(diào)至0.50～0.60麥?zhǔn)蠞岫?，將革蘭氏陰性細(xì)菌鑒定卡懸浮吸管插入鹽水管，并置于載卡臺上，將載卡臺置于VITEK2生化藥敏鑒定儀中，自動讀取結(jié)果。

1.2.3 藥敏試驗(yàn) 按VITEK2生化藥敏鑒定儀的說明，將3 mL無菌鹽水加入到清潔塑料管中，以無菌棉拭子挑取麥康凱瓊脂平板上形態(tài)相同的菌落至鹽水管中，混勻，用已校正的VITEK2比濁儀調(diào)至0.50～0.60麥?zhǔn)蠞岫?，微量移液器吸取該無菌鹽水145 μL，轉(zhuǎn)移至另一清潔塑料管內(nèi)3 mL無菌鹽水中，將革蘭氏陰性細(xì)菌藥敏卡懸浮吸管插入第二支鹽水管，置于載卡臺上，并將載卡臺放入儀器中，由儀器自動讀取結(jié)果。

藥敏結(jié)果分為三種敏感S(Susceptible)、中介I(Intermediate susceptibility)和耐藥R(Resistant)三種。

1.2.4 O抗血清型鑒定 按照大腸桿菌O型抗原定型血清說明進(jìn)行[5]。在麥康凱培養(yǎng)基上挑選光滑、完整的粉紅色菌落1～2個(gè)，接種于半固體小管，37 ℃培養(yǎng)24 h，取半固體培養(yǎng)物分別接種普通瓊脂斜面小管、普通肉湯小瓶培養(yǎng)基(50 mL)，置37 ℃培養(yǎng)24 h，培養(yǎng)期間振蕩普通肉湯數(shù)次。用0.50 %石炭酸生理鹽水溶液2 mL洗下普通瓊脂斜面小管培養(yǎng)物，置小圓底試管中，制成濃稠菌懸液，然后與普通肉湯小瓶培養(yǎng)物一起于121 ℃高壓2 h，破壞其“K”抗原，制成高壓抗原。取制備的待檢菌的O抗原及大腸埃希菌O抗原定型血清各10 μL，在玻片上混勻，30 s內(nèi)出現(xiàn)明顯凝集現(xiàn)象者為陽性反應(yīng)。同時(shí)，以制備的待檢菌O抗原與0.50 %石炭酸生理鹽水混合物作對照，觀察有無自凝集現(xiàn)象。

1.2.5 動物試驗(yàn) 取該菌12 h普通肉湯培養(yǎng)物，將菌液濃度調(diào)整為麥?zhǔn)蠞岫?.0，腹腔注射接種于5只20～30 g的小鼠，每只0.2 mL，同時(shí)設(shè)立2只以同樣途徑接種等量無菌普通肉湯的小鼠作為對照。接種后隔離飼養(yǎng)觀察，記錄死亡小鼠的死亡時(shí)間，并從死鼠腦組織中分離病原菌[5]。

1.2.6 DNA模板的制備 用煮沸法提取細(xì)菌DNA[6]，操作方法如下：

將分離菌在LB平板上復(fù)蘇37 ℃培養(yǎng)18～24 h。

用接種環(huán)挑取單個(gè)菌落，于無菌生理鹽水中制成麥?zhǔn)蠞岫葹?.50的菌懸液。取500 μL菌懸液于1.5 mL離心管中12000 rpm離心5 min.

棄上清，將沉淀重新用200 μL 1*TE溶液稀釋，100 ℃煮沸10 min,12000 rpm離心5 min。將上清液轉(zhuǎn)移到干凈無菌EP管中，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.7 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)Gen Bank 報(bào)道的CFR、OqxA、tetA、qnrA、gyrA、TEM基因及其兩側(cè)部分序列設(shè)計(jì)了引物序列如下(表1)：

表1 引物序列

由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.2.8 PCR反應(yīng) 根據(jù)文獻(xiàn)方法[6]，PCR反應(yīng)體系總體積為25 μL，在1.5 mL潔凈離心管中按計(jì)算結(jié)果依次加入雙蒸水8 μL，PCR反應(yīng)液(包含dNTPs、Taq酶)13 μL，該分離菌DNA模板2 μL，耐藥基因上下游引物各1 μL。

PCR反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性5 min,一個(gè)循環(huán)；94 ℃變性1 min，退火溫度55 ℃30 s，72 ℃延伸1 min,30個(gè)循環(huán)；終延伸72 ℃7 min，一個(gè)循環(huán)。對PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.9 瓊脂糖凝膠電泳 PCR產(chǎn)物用1.0 %瓊脂糖凝膠電泳。稱取1.0 g瓊脂糖，加至100 mL 1*TBE緩沖液，微波爐加熱使瓊脂完全溶解，稍冷卻即加Gel Red 4 μL，混勻后倒入選擇好的模具中，靜置30 min,待膠完全凝固后，撤去封條，將凝膠放入電泳槽中，小心拔掉梳子，將1*TBE緩沖液緩慢倒入電泳槽至沒過膠面。

以DNA Marker DL2000作參照，用微量移液器將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物5 μL，加入點(diǎn)樣孔中。電泳條件：電壓150 V，時(shí)間30 min。用BIOMETRA 紫外凝膠成像系統(tǒng)在紫外燈下成像，觀察結(jié)果，記錄并保存照片。

2 結(jié)果與分析

2.1 分離菌的培養(yǎng)特性及形態(tài)特征 經(jīng)37 ℃培養(yǎng)12 h,分離菌在沙門氏菌顯色培養(yǎng)基中形成灰藍(lán)色、圓滑、隆起菌落(圖1-A)；在尿路顯色培養(yǎng)基中形成淺粉紫色、圓形菌落(圖1-B)，在麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上形成粉紅色，圓形，隆起、光滑濕潤的中等大小菌落(圖1-C)，符合大腸桿菌的培養(yǎng)特性。挑取單個(gè)菌落革蘭氏染色后，在顯微鏡下可見革蘭氏陰性， 兩端鈍圓的短小桿菌(圖1-D)。

2.2 生化試驗(yàn)鑒定結(jié)果 VITEK2系統(tǒng)生化試驗(yàn)鑒定結(jié)果如表2所示,該結(jié)果顯示該分離菌可以利用D-葡萄糖、D-麥芽糖等糖類，VP試驗(yàn)為陰性，檸檬酸鹽(鈉)利用試驗(yàn)為陰性。該分離菌符合大腸桿菌生化反應(yīng)特征。

A：在沙門氏菌顯色培養(yǎng)基上生長的菌落(10×)；B：在尿路顯色培養(yǎng)基上生長的菌落(10×)；C：在麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上生長的菌落(10×)；D：經(jīng)革蘭氏染色后鏡檢照片(400×)圖1 分離菌培養(yǎng)特性及形態(tài)特征

試驗(yàn)項(xiàng)目結(jié)果試驗(yàn)項(xiàng)目結(jié)果側(cè)金盞花醇(0.19mg)-L-阿拉伯醇(0.30mg)-D-纖維二糖(0.30mg)-β-半乳糖苷酶(0.04mg)+尿素酶(0.15mg)-β-N-乙酰葡萄糖苷酶(0.04mg)-D-葡萄糖(0.30mg)+VP試驗(yàn)-葡萄糖發(fā)酵(0.45mg)+β-葡萄糖苷酶(0.04mg)-D-麥芽糖(0.30mg)+β-木糖苷酶(0.03mg)-蔗糖(0.30mg)-檸檬酸鹽(鈉)(0.05mg)-α-半乳糖苷酶(0.04mg)+β-葡萄糖苷酸酶(0.04mg)+

2.3 藥敏試驗(yàn)結(jié)果 VITEK2系統(tǒng)對分離純化的菌株進(jìn)行藥敏試驗(yàn)的結(jié)果如表3所示，表明該分離菌株對哌拉西林、頭孢替坦、厄他培南、亞胺培南等敏感，對頭孢唑林、頭孢他啶、慶大霉素、環(huán)丙沙星、左氧氟沙星等多種藥物耐藥，交叉耐藥性嚴(yán)重。

表3 分離菌藥敏試驗(yàn)結(jié)果(S：敏感R：不敏感)

2.4 分離菌株O抗血清型鑒定 制備的待檢菌O抗原與0.50 %石炭酸生理鹽水混合無凝集現(xiàn)象，說明該待檢菌O抗原無自凝集現(xiàn)象。與O114單因子血清混合后發(fā)生渾濁，有白色絮狀物出現(xiàn)(圖2-A)，與其他O抗原單因子血清混合后仍然呈透明均一狀態(tài)(圖2-B)。說明該分離菌O血清型為O114。

A：與O114抗原單因子血清混合后出現(xiàn)白色絮狀物；B：與其他抗原單因子血清混合后仍呈均一狀態(tài)。圖2 分離菌株血清型鑒定

2.5 動物試驗(yàn) 試驗(yàn)組小鼠72 h內(nèi)全部死亡，取死亡小鼠腦組織接種于麥康凱瓊脂培養(yǎng)基37 ℃培養(yǎng)12 h，有紅色菌落生長，與圖1-C形態(tài)一致；革

蘭氏染色后鏡檢符合大腸桿菌特征，與圖1-D一致，而對照組2只小鼠全部存活，說明該分離菌株為致病性大腸桿菌。

2.6 耐藥基因 該分離菌PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果見圖3。

圖3 該分離菌 PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果圖

由圖3觀察得知，該分離菌包含tetA、gyrA、oqxA、qnrA耐藥基因，產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(ESBLs)的分型為TEM，可介導(dǎo)多重耐藥的CFR基因在本次試驗(yàn)中未檢出，結(jié)果見表4。

表4 耐藥基因測序結(jié)果

3 討論

經(jīng)過生化鑒定試驗(yàn)證明該分離菌為大腸桿菌，動物回歸試驗(yàn)結(jié)果表明該分離大腸桿菌具有致病性。藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示，該菌株對哌拉西林、頭孢替坦、厄他培南等藥物敏感，對頭孢他啶、頭孢吡肟、慶大霉素等藥物產(chǎn)生耐藥。表明該菌株已對多種抗生素產(chǎn)生了耐藥性，耐藥性明顯增強(qiáng)。耐藥基因結(jié)果顯示該致病菌至少攜帶包括qnrA、tetA、oqxA、gyrA在內(nèi)的4種耐藥基因。產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(ESBLs)分型結(jié)果為TEM型，該類型常見于大腸桿菌和肺炎克雷伯菌，是我國分布較為廣泛的類型。

大腸桿菌是仔貂腦膜炎最常見的致病菌，大腸桿菌性腦膜炎一般是由于細(xì)菌的血型播散引起的[8]，但是，血液中的大腸桿菌如何穿過由腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞組成的血腦屏障，目前尚不清楚[9]。血腦屏障能夠阻止某些物質(zhì)由血液進(jìn)入腦組織[10]，血腦屏障的存在能夠保持腦組織內(nèi)環(huán)境的基本穩(wěn)定，對維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)正常生理狀態(tài)具有重要的生物學(xué)意義。試驗(yàn)中不僅分離得到了致病性大腸桿菌，且該分離菌對多種抗生素類藥物產(chǎn)生了耐藥性[11]，應(yīng)引起足夠的重視。試驗(yàn)檢測的4類耐藥基因，經(jīng)測序發(fā)現(xiàn)，均存在于大腸桿菌質(zhì)粒中，質(zhì)粒是獨(dú)立于細(xì)菌染色體之外的具有自我復(fù)制能力的小型環(huán)狀DNA，因此，位于質(zhì)粒上的耐藥基因，在細(xì)菌自我復(fù)制的過程中發(fā)生遺傳變異的可能性更大，給細(xì)菌耐藥性的防治帶來一定的難度。在畜牧養(yǎng)殖過程中，可通過在飼料中添加益生素[12]或中藥免疫增強(qiáng)劑來提高動物免疫力，減少動物發(fā)病，從而減少抗菌藥的使用。

研究從耐藥性等方面探究穿過血腦屏障的大腸桿菌的相關(guān)生物學(xué)特性，針對山東省水貂腦組織分離得到的致病性大腸桿菌的耐藥及耐藥基因攜帶情況的報(bào)道尚屬首次。

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(編 輯：陳希)

Isolation, Identification ofEscherichiacolifrom Mink and Related Research of Some Biological Characteristics

YANG Qing1,SHI You-fei1,CHEN Jing2,WANG Miao-li2,XU Hong2,WANG Gui-sheng2

(1.CollegeofAnimalScienceandTechnology,AgriculturalUniversityofShandong,Taian271018,China;2.CenterforcontrolandpreventionofanimaldiseasesinShandongProvince,Jinan250022,China)

To preliminary explore the resistance and resistance genes ofE.colifrom mink of Shandong province, O antiserum identification, drug sensitivity test and resistance gene test toE.coliwhich from 30 d dead mink’s brain. The result shows that the O antiserum type of this isolated is O114.The isolated resistance to many drugs and have three resistance genes at least. The result confirm that the isolated can through blood brain barrier and serious drug resistance, the phenomenon of cross drug resistance is serious.

Escherichiacoli;isolation and identification；blood brain barrier; drug resistance gene

楊 青，碩士研究生，從事細(xì)菌耐藥性方面工作。E-mail: qingy013@163.com

2015-04-07

A

1002-1280 (2015) 08-0014-06

S852.61