薛 飛 呂 毅 虢宏昌 馬 鋒 嚴(yán)小鵬 李建鵬 徐向華 陸建文 董鼎輝 朱皓陽(yáng) 白紀(jì)剛 李建輝 劉亞雄

(西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院肝膽外科，西安 710061)

?

·實(shí)驗(yàn)研究·

腹腔鏡與開(kāi)腹建立犬膽道梗阻模型的對(duì)比研究*

薛 飛 呂 毅**虢宏昌①馬 鋒 嚴(yán)小鵬 李建鵬 徐向華 陸建文 董鼎輝 朱皓陽(yáng) 白紀(jì)剛 李建輝 劉亞雄①

(西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院肝膽外科，西安 710061)

目的 探討腹腔鏡建造犬膽道梗阻模型的可行性及其與開(kāi)腹方式相比的優(yōu)越性。 方法 將16只本地健康雜種犬隨機(jī)分為2組，每組8只，分別行腹腔鏡或開(kāi)腹膽總管結(jié)扎術(shù)，比較2組手術(shù)時(shí)間、術(shù)后并發(fā)癥、術(shù)后麻醉復(fù)蘇、術(shù)后胃腸道恢復(fù)情況，以及術(shù)前、術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)白細(xì)胞、C反應(yīng)蛋白(C-reactive protein，CRP)及血清降鈣素原(procalcitonin，PCT)水平，術(shù)后10天進(jìn)行大體觀粘連Nair分級(jí)并取組織行病理學(xué)觀察。 結(jié)果 與開(kāi)腹組相比，腹腔鏡組手術(shù)時(shí)間短[(39.6±3.1)min vs. (69.4±8.6)min，t=-9.183，P=0.001]，麻醉蘇醒早[(58.8±10.9)min vs. (92.4±13.9)min，t=-5.380，P=0.001]，術(shù)后首次自主進(jìn)食早[(3.6±0.6)h vs. (6.8±1.1)h，t=-7.439，P=0.001]，首次排便早[(1.0±0.0)d vs. (1.9±0.6)d，t=-3.862，P=0.006]，各時(shí)點(diǎn)白細(xì)胞、CRP、粘連指數(shù)Nair評(píng)分、結(jié)扎部位膽道組織病理學(xué)分級(jí)，腹腔鏡組均優(yōu)于開(kāi)腹組且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，各時(shí)間點(diǎn)PCT、肝功能、膽紅素水平2組差異無(wú)顯著性(P>0.05)。 結(jié)論 腹腔鏡建造犬膽道梗阻模型是一種微創(chuàng)、簡(jiǎn)便的方式，炎癥水平及腹腔粘連程度較低，有利于二次手術(shù)和進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究。

腹腔鏡； 開(kāi)腹手術(shù)； 膽道梗阻； 動(dòng)物模型

膽道疾病是臨床常見(jiàn)病及多發(fā)病，同樣也是研究的熱點(diǎn)疾病，通過(guò)建立動(dòng)物模型進(jìn)行膽道疾病研究顯得尤為重要。通常所用的建造膽道梗阻模型的方式主要包括膽總管結(jié)扎法和膽道鉗夾法[1]，但均需開(kāi)腹進(jìn)行，費(fèi)時(shí)費(fèi)力的同時(shí)，也增加了手術(shù)的創(chuàng)傷度及風(fēng)險(xiǎn)性，諸多干擾因素也容易導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)偏倚。本研究團(tuán)隊(duì)探討利用腹腔鏡微創(chuàng)技術(shù)完成模型建立，簡(jiǎn)化操作方式，降低創(chuàng)傷及術(shù)后粘連程度。為進(jìn)一步印證腹腔鏡造模方式的優(yōu)勢(shì)所在，本研究針對(duì)腹腔鏡與開(kāi)腹兩種造模方式進(jìn)行比較，現(xiàn)將相關(guān)結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

本地雜種犬16只，體重10～15 kg，雌雄不限，由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供(SYXK陜2014-003)。本實(shí)驗(yàn)過(guò)程及對(duì)動(dòng)物的處置符合動(dòng)物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)，實(shí)驗(yàn)方案獲得西安交通大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(No.XJTULAC201-395)。將實(shí)驗(yàn)犬隨機(jī)分為2組，每組8只，分別進(jìn)行腹腔鏡或開(kāi)腹膽道結(jié)扎術(shù)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

手術(shù)器械及耗材均經(jīng)過(guò)高溫高壓滅菌處理，腹腔鏡設(shè)備及器械均購(gòu)置于Karl Storz GmbH & Co. KG公司。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物術(shù)前常規(guī)禁食12 h、禁水6 h。腹腔注射3%戊巴比妥鈉(1 mg/kg)全身麻醉。麻醉起效后，腹部剃毛，仰臥位固定，消毒，鋪無(wú)菌手術(shù)單。

1.2.1 開(kāi)腹組 上腹正中切口入腹，長(zhǎng)約10 cm。生理鹽水紗布覆蓋胃十二指腸，向下腹部牽拉，充分暴露肝門(mén)部結(jié)構(gòu)。仔細(xì)分離，顯露膽總管長(zhǎng)約1 cm，直徑1～2 mm，近十二指腸緣處用4-0不可吸收絲線結(jié)扎。檢查無(wú)出血、膽漏后關(guān)腹，術(shù)后給予抗炎補(bǔ)液對(duì)癥處理。

1.2.2 腹腔鏡組 采用三孔法。2把巾鉗提起臍上緣腹壁皮膚，切開(kāi)皮膚、皮下層長(zhǎng)約1 cm，垂直穿刺置入氣腹針，檢查確定氣腹針在腹腔內(nèi)后，接通CO2氣腹機(jī)。開(kāi)始充氣時(shí)，速度不宜太快，以1 L/min為宜。嚴(yán)密觀察犬的呼吸和心率，維持氣腹壓力10 mm Hg(1 mm Hg=0.133 kPa)。于穿刺部位置入10 mm trocar和腹腔鏡，左鎖中線肋緣下2 cm置入10 mm trocar，右鎖中線肋緣下2 cm置入5 mm trocar。抓鉗鉗夾生理鹽水紗布撐起肝臟，充分顯露肝門(mén)部，電鉤結(jié)合分離鉗鈍性分離肝十二指腸韌帶，于十二指腸上緣處分離膽總管長(zhǎng)約5 mm，直徑1～2 mm。近十二指腸上緣處以4-0不可吸收絲線結(jié)扎。檢查腹腔內(nèi)無(wú)活動(dòng)性出血后關(guān)閉各穿刺孔，術(shù)后嚴(yán)密觀察。

1.3 觀察指標(biāo)

1.3.1 手術(shù)時(shí)間 記錄從切皮至縫皮結(jié)束所用的時(shí)間。

1.3.2 外周血檢測(cè) 術(shù)前1 d、術(shù)后3 d、術(shù)后7 d以及術(shù)后10 d分別從大隱靜脈采集靜脈血，行血常規(guī)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、直接膽紅素、間接膽紅素、總膽紅素、C反應(yīng)蛋白(CRP)及血清降鈣素原(PCT)測(cè)定。

1.3.3 術(shù)后恢復(fù)情況 記錄術(shù)后麻醉清醒時(shí)間(動(dòng)物意識(shí)恢復(fù)表現(xiàn)為睜眼及四肢少量活動(dòng))、術(shù)后首次自主進(jìn)食水時(shí)間及術(shù)后首次排糞便時(shí)間。密切觀察手術(shù)相關(guān)并發(fā)癥，包括切口滲血、感染、裂開(kāi)，切口疝，死亡等。

1.3.4 大體觀察 術(shù)后10 d，2組均再次開(kāi)腹，觀察腹腔內(nèi)粘連情況。根據(jù)Nair五級(jí)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)[2,3]對(duì)腹腔粘連程度進(jìn)行分級(jí)：0級(jí)，完全無(wú)粘連；Ⅰ級(jí)，單個(gè)纖細(xì)粘連；Ⅱ級(jí)，單個(gè)或2個(gè)輕度粘連，粘連帶寬<1 cm；Ⅲ級(jí)，重度粘連，2個(gè)以上粘連或1個(gè)粘連帶寬>1 cm；Ⅳ級(jí)，廣泛或切口下粘連。

1.3.5 組織學(xué)觀察 取小塊結(jié)扎處的膽總管組織(16只實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繼續(xù)行膽腸吻合實(shí)驗(yàn)研究，另外報(bào)道)，以10%甲醛固定，石蠟包埋、切片，行常規(guī)HE染色及Masson染色，顯微鏡下觀察切片并分級(jí)[4]。HE染色按漿膜側(cè)纖維結(jié)締組織增生及膠原化的程度分級(jí)[5]：Ⅰ級(jí)，少量纖維組織增生(<10%)；Ⅱ級(jí)，中等量纖維組織增生(10%～50%)；Ⅲ級(jí)，大量纖維組織增生(>50%)。Masson染色以粘連部位總膠原含量情況進(jìn)行分級(jí)(膠原組織顯藍(lán)色，分級(jí)判定結(jié)果在高年資病理診斷醫(yī)生指導(dǎo)下完成)：Ⅰ級(jí)，粘連組織呈淺藍(lán)色；Ⅱ級(jí)，粘連組織呈藍(lán)色；Ⅲ級(jí)，粘連組織呈深藍(lán)色。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 手術(shù)時(shí)間及術(shù)后恢復(fù)情況(表1)

與開(kāi)腹組相比，腹腔鏡組手術(shù)時(shí)間短，麻醉清醒早，術(shù)后首次自主進(jìn)食和排便早。腹腔鏡組無(wú)術(shù)后并發(fā)癥發(fā)生，開(kāi)腹組切口感染4例，切口裂開(kāi)1例，無(wú)出血、死亡等發(fā)生。

*Fisher’s Exact Test

2.2 外周血檢查結(jié)果(表2)

2組術(shù)后白細(xì)胞水平均明顯升高，腹腔鏡組升高幅度明顯小于開(kāi)腹組，且于術(shù)后7日降至正常，優(yōu)于開(kāi)腹組；CRP水平腹腔鏡組無(wú)變化，始終小于最低檢出水平，而開(kāi)腹組術(shù)后明顯升高；手術(shù)前后PCT水平2組改變不大；各肝酶水平以及膽紅素變化差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表2 2組不同時(shí)間點(diǎn)各項(xiàng)血液檢查結(jié)果比較(n=8)

2.3 大體和組織學(xué)觀察(表3)

術(shù)后10 d，腹腔鏡組普遍粘連較少，各組織結(jié)構(gòu)游離度良好，開(kāi)腹組粘連帶較多且寬，不易于分離(圖1)，根據(jù)Nair五級(jí)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，2組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.003)。

結(jié)扎部位組織HE染色可見(jiàn)腹腔鏡組組織黏膜、漿膜層完整連續(xù)，腺體較豐富、排布規(guī)整，散在少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，漿膜外少量纖維結(jié)締組織增生；開(kāi)腹組可見(jiàn)漿膜層連續(xù)性不完整，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)較多，漿膜外大量纖維結(jié)締組織增生(圖2)。根據(jù)組織漿膜側(cè)纖維結(jié)締組織增生及膠原化的程度分級(jí)，開(kāi)腹組較腹腔鏡組嚴(yán)重(P=0.043)。

Masson染色鏡下可見(jiàn)腹腔鏡組漿膜層外少量膠原組織成分，染色呈淺藍(lán)色，根據(jù)總膠原含量進(jìn)行分級(jí)多為Ⅰ級(jí)，開(kāi)腹組漿膜層外膠原組織較多，染色呈深藍(lán)(圖3)，分級(jí)多為Ⅲ級(jí)，2組比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.009)。

表3 2組術(shù)后大體和組織學(xué)分級(jí)(n=8)

圖1 術(shù)后10 d結(jié)扎部位大體觀，腹腔鏡組粘連Ⅰ級(jí)(A)，開(kāi)腹組Ⅲ級(jí)(B) 圖2 結(jié)扎部位HE染色(×100)，腹腔鏡組HE分級(jí)Ⅰ級(jí)(A)，開(kāi)腹組Ⅲ級(jí)(B) 圖3 結(jié)扎部位Masson染色(×100)，腹腔鏡組Masson分級(jí)Ⅱ級(jí)(A)，開(kāi)腹組Ⅲ級(jí)(B)

3 討論

通過(guò)建立動(dòng)物疾病模型來(lái)研究疾病機(jī)制的方法已經(jīng)很成熟，也是越來(lái)越被廣大科研人員所認(rèn)可的方法之一。疾病的動(dòng)物模型主要可以分為自發(fā)模型、手術(shù)模型、化學(xué)誘導(dǎo)模型和當(dāng)前國(guó)際生物醫(yī)學(xué)研究火熱的基因組改造模型[6]。利用動(dòng)物模型來(lái)研究的膽道疾病也有很多，如膽管炎、膽結(jié)石、膽道梗阻等。動(dòng)物模型基本上都是開(kāi)腹手術(shù)完成，手術(shù)創(chuàng)傷大、風(fēng)險(xiǎn)性高、術(shù)后粘連重等因素嚴(yán)重影響下一步實(shí)驗(yàn)研究的進(jìn)行。探索一種新型的建模技術(shù)，在保證模型建立成功的前提下，盡可能降低手術(shù)創(chuàng)傷所帶來(lái)的影響，成為目前手術(shù)動(dòng)物建模中有待解決的問(wèn)題。

腹腔鏡技術(shù)作為當(dāng)今世界醫(yī)學(xué)發(fā)展的重要標(biāo)志之一，其微創(chuàng)、恢復(fù)快等優(yōu)點(diǎn)得到了人們的充分認(rèn)識(shí)與肯定，并在短短的幾十年內(nèi)應(yīng)用于醫(yī)學(xué)的多個(gè)領(lǐng)域[7]。國(guó)內(nèi)外動(dòng)物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域也有部分應(yīng)用腹腔鏡進(jìn)行簡(jiǎn)單的動(dòng)物手術(shù)的報(bào)道，例如：Pukacz等[8]在腹腔鏡下完成犬子宮卵巢切除術(shù)，并證明其方法的可行性，Runge等[9]用腹腔鏡進(jìn)行動(dòng)物隱睪切除術(shù)，時(shí)鑫等[10]運(yùn)用腔鏡技術(shù)完成了動(dòng)物腹腔多臟器手術(shù)教學(xué)?；诟骨荤R動(dòng)物外科手術(shù)的先例，加之本研究團(tuán)隊(duì)長(zhǎng)期以來(lái)在微創(chuàng)外科手術(shù)方面的探索，我們探討通過(guò)腹腔鏡技術(shù)來(lái)完成犬膽道梗阻模型的建立，并與開(kāi)腹膽道結(jié)扎組進(jìn)行對(duì)比實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示：腹腔鏡組較短的手術(shù)時(shí)間及麻醉時(shí)間大大縮短了動(dòng)物術(shù)后復(fù)蘇過(guò)程，動(dòng)物清醒較早，進(jìn)食時(shí)間較快導(dǎo)致術(shù)后恢復(fù)情況與開(kāi)腹組相比具有明顯優(yōu)勢(shì)，大大降低了動(dòng)物術(shù)后并發(fā)癥的發(fā)生。對(duì)白細(xì)胞、C反應(yīng)蛋白定期檢測(cè)結(jié)果顯示，腹腔鏡組相比于開(kāi)腹組創(chuàng)傷較輕、炎癥反應(yīng)小且炎癥下降快，充分證明了腹腔鏡組微創(chuàng)化的操作方式更利于膽道梗阻動(dòng)物模型的建立。

腹部手術(shù)后腹腔粘連是最常見(jiàn)的并發(fā)癥之一，尤其在開(kāi)腹手術(shù)之后，其發(fā)生率為63%～97%[11～13]。近幾年的研究表明，術(shù)后腹腔粘連與手術(shù)創(chuàng)傷、局部炎癥反應(yīng)及富含纖維素的滲出等因素有關(guān)，纖維素交織成網(wǎng)，在損傷處形成橋式連接以利于漿膜修復(fù)[14]。在這過(guò)程中，結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(CTGF)等多種因子的共同作用促進(jìn)了術(shù)后腹腔纖維素及新生血管的生成，最終形成永久性的臟器粘連[15]。腹腔鏡具有創(chuàng)傷小、炎癥輕的優(yōu)勢(shì)，術(shù)后腹腔內(nèi)粘連較輕；國(guó)內(nèi)外臨床實(shí)例或動(dòng)物實(shí)驗(yàn)亦有報(bào)道，腹腔鏡手術(shù)能有效避免空氣以及術(shù)者對(duì)臟器的直接接觸，大大降低術(shù)后臟器粘連程度[16～18]。我們通過(guò)腹腔鏡技術(shù)實(shí)現(xiàn)膽道結(jié)扎動(dòng)物模型構(gòu)建，相比于開(kāi)腹組降低了炎癥反應(yīng)及感染程度，減少了因炎癥反應(yīng)刺激導(dǎo)致的纖維蛋白滲出及纖維性粘連，膠原的沉積。并通過(guò)Nair五級(jí)粘連評(píng)分以及HE、Masson染色得以證實(shí)，腹腔鏡組術(shù)后粘連程度較輕。

總體來(lái)說(shuō)，腹腔鏡建造動(dòng)物模型具有以下幾點(diǎn)優(yōu)勢(shì)：①腹腔鏡建模方便、簡(jiǎn)易、手術(shù)時(shí)間短，較短的手術(shù)時(shí)間便于動(dòng)物麻醉復(fù)蘇，大大降低了麻醉所帶來(lái)的手術(shù)風(fēng)險(xiǎn)；②腹腔鏡建模創(chuàng)傷小、炎癥輕、術(shù)后并發(fā)癥少、胃腸功能恢復(fù)快無(wú)須限制術(shù)后進(jìn)食，便于機(jī)體功能恢復(fù)；③腹腔鏡建模術(shù)后腹腔粘連輕，尤其適用于需二次開(kāi)腹手術(shù)的動(dòng)物疾病模型，如消化道穿孔動(dòng)物模型、臟器出血?jiǎng)游锬Ｐ汀⒐Ｗ枘Ｐ图案鼓ぱ讋?dòng)物模型等。本實(shí)驗(yàn)擬通過(guò)建造犬膽道梗阻模型進(jìn)一步行膽腸吻合實(shí)驗(yàn)研究，密集的兩次手術(shù)不僅增大了動(dòng)物死亡的風(fēng)險(xiǎn)，而且嚴(yán)重的腹腔粘連大大增加了二次手術(shù)的難度，因此腹腔鏡建模無(wú)疑是最好的建模選擇。腹腔鏡動(dòng)物建模方式仍有許多局限，腹腔鏡器械較昂貴，無(wú)法滿足普通動(dòng)物外科實(shí)驗(yàn)室的需求；同時(shí)，腹腔鏡手術(shù)僅限于豬、狗、羊等大動(dòng)物手術(shù)操作，但開(kāi)展大動(dòng)物手術(shù)的實(shí)驗(yàn)室甚少，大部分仍以老鼠、兔子等小動(dòng)物為主；腔鏡操作難度相對(duì)較高、學(xué)習(xí)曲線長(zhǎng)也限制了其廣泛應(yīng)用。但我們?nèi)猿錆M信心，相信這種方式能給更多的動(dòng)物模型建造帶來(lái)啟示，更多的微創(chuàng)、簡(jiǎn)便的造模方式有待我們進(jìn)一步探索與發(fā)現(xiàn)。

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(修回日期：2015-03-27)

(責(zé)任編輯：王惠群)

A Comparative Study Between Laparoscopy and Laparotomy in Establishing Biliary Obstruction Model in Dogs

XueFei*,LüYi*,GuoHongchang,etal.

*DepartmentofHepatobiliarySurgery,FirstAffiliatedHospitalofXi’anJiaotongUniversity,Xi’an710061,China

Correspondingauthor:LüYi,E-mail:luyi169@126.com

Objective To explore the feasibility of using laparoscopic technique to create animal model of biliary occlusion and its advantages as compared to laparotomy. Methods Sixteen local mongrel dogs were randomly divided into two groups with 8 dogs in each group. One group was given laparoscopic common bile duct ligation and the other group underwent laparotomy. The operation time, postoperative complications, anesthesia recovery time, gastrointestinal tract recovery condition, and the leucocyte, C-reactive protein (CRP) and procalcitonin (PCT) before and after operations were tested in different time points between the two groups. The histological features of ligation parts and the level of intraperitoneal adhesion (Nair score) were examined 10 days after operation. Results As compared to the laparotomy group, the laparoscopy group had significant shorter operation time [(39.6±3.1) min vs. (69.4±8.6) min,t=-9.183,P=0.001], shorter anesthesia recovery time [(58.8±10.9) min vs. (92.4±13.9) min,t=-5.380,P=0.001], earlier first eating time [(3.6±0.6) h vs. (6.8±1.1) h,t=-7.439,P=0.001], and earlier first defecation time [(1.0±0.0) d vs. (1.9±0.6) d,t=-3.862,P=0.006]. The leucocyte counts and CRP levels of different time points, adhesion index (Nair score), and histological grading of ligated bile duct in the laparoscopy group were superior to those in the laparotomy group (P<0.05). There were no significant differences in liver functions, serum PCT, and bilirubin value at different time points between the two groups (P>0.05). Conclusions Laparoscopic biliary occlusion is a simple and minimal invasive way to establish animal models. The technique is helpful to second operation and further study because of its lower inflammation rate and abdominal adhesion extent.

Laparoscopy; Laparotomy; Biliary obstruction; Animal model

國(guó)家自然科學(xué)基金科學(xué)儀器專項(xiàng)(81127005)；國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(51275387)

R-332

A

1009-6604(2015)08-0729-05

10.3969/j.issn.1009-6604.2015.08.018

2014-11-28)

**通訊作者，E-mail：luyi169@126.com

① (西安交通大學(xué)機(jī)械制造系統(tǒng)工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，西安 710049)