摘要：以粉碎的大豆為發(fā)酵底物，用深黃被孢霉進行液態(tài)發(fā)酵，通過檢測發(fā)酵過程中菌絲的形態(tài)、提油量的變化和油脂成分，以探尋有助于提高大豆出油總量的方法。研究結(jié)果表明，深黃被孢霉在以大豆為發(fā)酵底物的條件下，能觀察到菌絲中有油脂的積累，并且大豆在經(jīng)深黃被孢霉發(fā)酵144 h后油脂提取量最大，在提取時間3 h的情況下，油脂提取率達到了89.39%，與相同培養(yǎng)、提油條件下沒有經(jīng)過微生物發(fā)酵的油脂比較，提取量提高了31.79%，經(jīng)過深黃被孢霉發(fā)酵后的大豆油脂多不飽和脂肪酸含量比未經(jīng)過發(fā)酵的大豆油增加了9%。

關鍵詞：大豆；深黃被孢霉；液態(tài)發(fā)酵；油脂提取率；脂肪酸成分

中圖分類號： TS225.1+3文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2015）02-0269-02

收稿日期：2014-11-05

基金項目：貴州省科學技術基金（編號：黔科合J字[2011]32號）。

作者簡介：牛曉娟（1983—），女，黑龍江大慶人，碩士，講師，主要從事應用微生物的研究。Tel：（0851）6702541；E-mail：252984899@qq.com。

通信作者：邱樹毅，博士，教授，主要從事應用微生物、化學工程、食品工程的研究。E-mail：syqiu@gzu.edu.cn。油料作物的常規(guī)提油方法主要是機械壓榨和有機溶劑浸出法，不能有效地分解細胞壁和破壞油脂蛋白質(zhì)體，導致提油后餅粕中殘留較多的油脂，油脂提油率不高。研究表明，在提取的過程中加入能夠破壞細胞壁和油脂體的酶[1-2]，將有助于在較短的時間里提高油料種子的提油率。Shah等采用三相分離的方法應用于麻瘋樹籽油脂的提取，在三相分離提取前用一種叫做Protizyme的混合酶進行預處理，在超聲波振動下僅僅2 h，出油率就達到98%[3]。Sharma等將含酸性、中性、堿性蛋白酶的混合酶加入到花生種籽中，在設定條件下保溫18 h，花生油提取率達到了92%[4]。本研究利用產(chǎn)油微生物可能產(chǎn)生的酶類代替現(xiàn)成的工業(yè)酶制劑的部分作用（破壞細胞壁或者分解蛋白質(zhì)、糖類等），不僅可以使油料作物本身出油率提高，產(chǎn)油微生物還可以利用油料作物本身的碳水化合物產(chǎn)生微生物油脂，兩者油脂累加可提高出油率，把生物發(fā)酵法更好地應用于油脂提取，可以大大節(jié)省油脂提取的成本。

1材料與方法

1.1材料

大豆購自貴陽市煤礦村市場。

1.2菌種

深黃被孢霉（Mortierella isabellina，AS 3.3410），購自中國科學院微生物研究所，使用前先進行活化。

1.3培養(yǎng)基

1.3.1菌種保藏培養(yǎng)基PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯浸取液 1.0 L，葡萄糖20.0 g，KH2PO4 3.0 g，MgSO4·7H2O 1.5 g，維生素B1微量，瓊脂15.0 g，pH值6.0，1×105 Pa滅菌30 min。

1.3.2種子培養(yǎng)基深黃被孢霉種子培養(yǎng)液：馬鈴薯浸取液1.0 L，葡萄糖20.0 g，KH2PO4 3.0 g，MgSO4·7H2O 1.5 g，pH 值6.0。

1.3.3發(fā)酵培養(yǎng)基大豆發(fā)酵培養(yǎng)基：粉碎過的大豆10 g，自來水100 mL，pH值自然。

1.4試驗方法

挑取保存于斜面的少量菌絲，于PDA斜面培養(yǎng)基上 28 ℃ 培養(yǎng)3 d，直至長出大量孢子。用無菌水沖洗斜面上的孢子，并用移液槍吸取500 μL接入100 mL的液體種子培養(yǎng)基中，于28 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)24 h。然后將種子液按1%的比例接種到裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，三角瓶裝液量均為100 mL，于28 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)144 h。每隔24 h取樣進行油脂提取。

1.4.1粗脂肪的測定以乙醚作溶劑，采用索氏提取的方法對烘干過的樣品進行油脂提取，一般認為索氏提取8 h可以把樣品中的油脂提取完全[5]，即為油料作物的總脂肪含量。本試驗把培養(yǎng)條件相同但未接種深黃被孢霉、油脂提取時間為3 h作為對照。

計算公式：

粗脂肪含量=m2-m1m×100%。

式中：m1為抽提瓶質(zhì)量（g），m2為索氏抽提后抽提瓶和油脂總質(zhì)量（g），m為樣品的質(zhì)量（g）。

1.4.2脂肪酸成分分析日本島津GC-2014型氣相色譜儀配以FID檢測器和聚乙二醇（PEG）毛細管色譜柱（30 m×0.53 mm×0.53 μm）。氣體流量：以高純氮作為載氣，F(xiàn)ID檢測器的氫氣和空氣流量比為50 ∶50 kPa，流速為 1.5 mL/min；柱溫：180 ℃ 保溫2 min后，以5 ℃/min升溫至 230 ℃，在230 ℃ 保持15 min；溫度條件：進樣口溫度250 ℃，檢測器溫度280 ℃；進樣量為1 μL；分流比為20 ∶1；對照脂肪酸甲酯標準品的保留時間，對經(jīng)接種深黃被孢霉、接種黑曲霉和未接種微生物處理提取的大豆油分別進行脂肪酸成分的測定。

2結(jié)果與分析

2.1菌絲形態(tài)

接種深黃被孢霉的大豆發(fā)酵液在培養(yǎng)120 h后，培養(yǎng)液中肉眼可見乳白色的菌絲球，直徑如小米粒大小。取樣在光學顯微鏡放大100倍條件下觀察（圖1），可以看到有黃色油滴狀微生物存在，在光學顯微鏡放大1 000倍的情況下（圖2）觀察，可以看到深黃被孢霉的菌絲形態(tài)。表明深黃被孢霉能夠以大豆為發(fā)酵底物進行生長和代謝，并積累油脂。

2.2油脂提取量

經(jīng)索氏提取8 h后的大豆（沒有經(jīng)過發(fā)酵處理）提油量為23.00%（m/m）（即試驗用大豆的總油脂含量為23.00%）；經(jīng)索氏提取3 h后的大豆（沒有經(jīng)過發(fā)酵處理）提油量為156%（m/m）（即對照組提油量為15.60%）。從圖3可以看出，接種深黃被孢霉的大豆在發(fā)酵后144 h，油脂提取時間3 h時達到最大提油量，為20.56%，油脂提取率達89.39%，比對照組提高了31.79%。表明深黃被孢霉對提高大豆提油率發(fā)揮了一定的促進作用。endprint

2.3不同處理大豆油脂的主體成分檢測

接種深黃被孢霉的大豆脂肪酸中亞油酸、亞麻酸、花生烯酸3種多不飽和脂肪酸的含量占總脂肪酸含量的72.06%，未經(jīng)過發(fā)酵提取的大豆油中3種多不飽和脂肪酸含量占總脂肪酸含量的66.10%，為了進一步證明深黃被孢霉在以大豆為發(fā)酵底物產(chǎn)生了微生物油脂，我們對能提高大豆油脂提取率的另1株微生物黑曲霉在相同培養(yǎng)條件以及提油條件下做了脂肪酸成分分析（表1），分析結(jié)果表明脂肪酸成分與未發(fā)酵的相比變化不大。

3結(jié)論

產(chǎn)油微生物可以利用大豆本身的碳水化合物產(chǎn)出多元不飽和脂肪酸豐富的微生物油脂，再加上大豆本身提取的油脂，兩者油脂累加從而提高了大豆的出油率。多不飽和脂肪酸具有特殊的生物學功能，采用深黃被孢霉發(fā)酵會使大豆油脂中多不飽和脂肪酸含量的增加。

參考文獻：

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[3]Shah S，SharmaA，Gupta M N. Extraction of oil from Jatropha curcas L. seed kernels by combination of ultrasonication and aqueous enzymatic oil extraction[J]. Bioresource Technology，2005（96）：121-123.

[4]Sharma A，Khare S K，Gupta M N. Enzyme-assisted aqueous extraction of peanut oil[J]. JAOCS，2002，79（3）：215-218.

[5]GB/T 5512—2008糧油檢驗糧食中粗脂肪含量測定[S].

任敏，朱紅霞，張家洋，等. 無銀保鮮劑對香石竹的保鮮效應[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學，2015，43（2）：271-272.endprint