朱愛榮+霍如林+張林+高峰+周光宏

摘要：為了制備可用于檢測氟苯尼考的特異性多克隆抗體，采用戊二醛法合成氟苯尼考的人工抗原FFA-BSA、FFA-OVA、紫外分光光度計進行鑒定，用FFA-BSA免疫BALB/C雌性小鼠獲得可用于檢測氟苯尼考的特異性多克隆抗體，并用間接ELISA法對其進行特異性鑒定。結果顯示：經過紫外掃描鑒定，成功合成了人工抗原合 FFA-BSA 和FFA-OVA，偶聯比分別為12 ∶1和11 ∶1。制備的抗體效價低于1 ∶32 000，抑制率為50%（IC50）時的氟苯尼考濃度為36.9 ng/mL?？梢?，本試驗制備的氟苯尼考多克隆抗體具有較好的親和力和高特異性，有良好的應用價值。

關鍵詞：氟苯尼考；人工抗原；BALB/C雌性小鼠；多克隆抗體

中圖分類號： S859.79+6文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2015）02-0201-04

收稿日期：2014-03-19

基金項目：國家科技支撐計劃（編號：2012BAD28B03）；江蘇省農業(yè)三新工程項目[編號：SX（2011）146]。

作者簡介：朱愛榮（1990—），女，安徽宣城人，碩士研究生，主要從事動物營養(yǎng)調控與畜產品品質研究。Tel：（025）84399007；E-mail：2011105044@njau.edu.cn。

通信作者：高峰，教授，主要從事動物營養(yǎng)調控與畜產品品質研究。Tel：（025）84399007；E-mail：gaofeng0629@ sina.com。氟苯尼考（florfenicol，FF）別稱氟甲砜霉素，具有抗菌廣譜、吸收速度快、體內分布廣、無潛在性再生障礙性貧血等優(yōu)點[1]，因此，氟苯尼考被廣泛使用在水產、畜禽養(yǎng)殖中，用于防治動物的感染性疾病[2]。然而，在動物生產中，氟苯尼考的不規(guī)范使用和濫用導致其在動物食品中產生殘留，進而對消費者健康構成潛在威脅，產生血液系統(tǒng)毒性[3]和胚胎毒性[4]；動物用藥后甚至會出現短暫的厭食、腹瀉和炎癥等不良反應[3-4]，因此，國內外相繼規(guī)定了氟苯尼考在動物性食品中的最高殘留限量[2]。目前，關于氟苯尼考的檢測方法較多，主要包括高效液相色譜法[5-6]、氣相色譜法[7]、氣質聯用[8]、液質聯用[9-10]和免疫學方法[11-12]等。理化分析法對操作人員要求苛刻，需要昂貴的設備，樣品前處理時間長，不適合大批量樣品的篩選；而免疫學方法相對簡單、快速和經濟；膠體金免疫層析技術是以膠體金為標記物的免疫層析方法，具有攜帶方便、操作簡單、特異敏感、成本低、不需儀器或僅需簡單儀器、肉眼下幾分鐘即可觀察到試驗結果的優(yōu)點，適合現場檢測[13-14]。制備好的抗體是免疫學檢測的前提條件。氟苯尼考是小分子物質，其化學結構式見圖1，分子量為358.22，本身沒有免疫原性，目前還未見到關于氟苯尼考的快速檢測試紙條的報道。本試驗通過氟苯尼考的改造體氟苯尼考胺與載體蛋白相偶聯合成人工抗原，并用人工抗原免疫小鼠獲得高特異性抗體，為研制快速檢測氟苯尼考殘留的膠體金免疫層析試紙條奠定基礎。

1材料與方法

1.1材料與試劑

1.1.1材料6周齡BABLB/C雌性小鼠，購自北京華阜康生物科技股份有限公司。

1.1.2主要試劑含量>98.0%的氟苯尼考胺；弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑、卵清白蛋白（OVA）、辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠IgG、TMB，Sigma-Aldich公司；含量>98.0%的牛血清白蛋白（BSA），Amresco公司；DMF（N，N-二甲基甲酰胺）、戊二醛等其他試劑均為國產分析純。

PBS緩沖液（pH值 7.4）包括0.2 g KH2PO4、2.9 g Na2HPO4·12H2O、0.2 g KCl、8.0 g NaCl、1 L蒸餾水；CB包被液（pH值 9.6）包括0.17 g Na2CO3、0.28 g NaHCO3、100 mL 去離子水；PBST洗滌液包括含0.05%Tween-20的PBS；封閉液包括含1%BSA的PBS；底物顯色A液包括 13.6 g CH3COONa、1.6 g C6H8O7·H2O、0.3 mL 30% H2O2、500 mL蒸餾水；底物顯色B液包括0.2 g EDTA-Na2、0.95 g C6H8O7·H2O、50 mL甘油、0.2 g TMB、500 mL蒸餾水；終止液：取濃H2SO4 27.62 mL緩緩加入到473 mL的蒸餾水中，混合即可，在加入硫酸的過程中不要加得太快，以免過熱。

1.1.3主要儀器UV-2450 紫外-可見分光光度計（島津分析儀器公司）；酶標儀（美國Thermo 公司）。

1.2方法

1.2.1氟苯尼考人工抗原的合成氟苯尼考人工抗原的制備依據趙朋玲等的方法[15-16]：將14 mg BSA溶于4 mL 0.01 mol/L PBS（pH值7.4）中，磁力攪拌下逐滴加入1 mL DMF（含2 mg氟苯尼考胺）中，待混勻后，磁力攪拌下逐滴加入50μL 25%戊二醛于反應液中，4 ℃下攪拌過夜，反應液于4 ℃、pH值7.4 的PBS中透析72 h，每8 h換液1次；收集透析液中成分一半于4 ℃下保存供檢測用，一半于-20 ℃下保存供免疫用，合成路線如圖2所示。同法合成FFA-OVA包被原。

1.2.2人工抗原的鑒定紫外掃描法：用紫外分光光度計鑒定FFA與載體蛋白的偶聯是否成功。用PBS精確配制FFA、BSA和OVA標準溶液，然后吸取一定量的FFA-BSA和FFA-OVA 儲備液，稀釋適宜倍數后，在200～400 nm下分別測定其吸光度，根據反應前后紫外吸收光譜的變化情況判斷偶聯是否成功。

1.2.3人工抗原結合比的測定用紫外分光光度計確定氟苯尼考胺的最大吸收波長，然后在氟苯尼考胺最大吸收波長下測定人工抗原和載體蛋白的吸光度，按照如下公式[17]計算FFA-BSA和FFA-OVA的結合比：結合比=（ε偶聯物-ε載體蛋白）/ε半抗原，其中ε為摩爾吸光系數；ε=D/（c×b），其中D為吸光度，c為濃度，b為比色皿光徑。endprint

1.2.4人工抗體的制備免疫前先尾靜脈取血，作陰性對照。用FFA-BSA免疫6周齡BALB/C小鼠6只，背部皮下多點注射，免疫劑量為100 μg/只（即0.2 mL/只）[18]。首次免疫，取無菌PBS溶解的FFA-BSA，與等體積的弗氏完全佐劑混合，漩渦混合儀上充分乳化；強免疫，弗氏佐劑改用弗氏不完全佐劑，其余同前[19]。共免5次，每次間隔2周，每次免疫后第10天斷尾采血，最后一次免疫后第10天眼眶采血，4 ℃ 過夜析出血清，3 000 r/min下離心10 min，取上清[20-21]，一部分直接于4 ℃冰箱內保存，一部分-20 ℃下保存?zhèn)溆?，收集的抗血清用硫酸胺法進行純化[20]。

1.2.5包被抗原濃度的選擇用棋盤滴定法確定最佳包被濃度：用包被緩沖液將包被抗原作系列稀釋，濃度分別為10.0、8.0、6.0、4.0、2.0、1.0、0.5 μg/mL；用抗體稀釋液將二免后抗血清作倍比稀釋，濃度分別為1 ∶800、1 ∶1 600、1 ∶3 200、1 ∶6 400、1 ∶12 800、1 ∶25 600、1 ∶51 200。在96孔板上從左到右依次加入包被抗原，從上到下依次加入抗血清。按所建立的間接ELISA方法進行操作，D值選取1.0左右，且以處在曲線平臺下降的那一點包被濃度作為最佳抗原抗體稀釋條件[20]。

1.2.6間接ELISA法測抗體效價操作步驟：（1）抗原包被。將包被原用包被液稀釋至最佳包被濃度。100 μL/孔加入到聚苯乙烯酶聯檢測板各孔中，37 ℃包被2 h，洗滌2次，5 min/次，拍干。（2）封閉。加入封閉液200 μL/孔，37 ℃封閉3 h，洗滌3次，拍干。（3）加待測樣品。倍比稀釋的五免抗血清100 μL/孔，以正常小鼠陰性血清作對照，37 ℃孵育 30 min，洗滌3次，拍干。（4）加二抗。用封閉液將辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠IgG稀釋，100 μL/孔，37 ℃孵育30 min，洗滌3次，拍干。（5）顯色。加入A、B液各80 μL/孔，37 ℃顯色15 min。（6）終止。加入終止液80 μL/孔。（7）讀數。在450 nm單波長下測定各孔的D值，以與陰性對照孔D值的比值（P/N）大于2.1為限，作為判斷效價的臨界點。

1.2.7間接ELISA法測抗體靈敏性用間接競爭ELISA法測定抗血清的特異性，采用本研究所確定的最佳包被濃度和抗體稀釋濃度，將“間接ELISA方法”中的第三步替換為“分別加入系列稀釋的FF標準品50μL/孔和最佳稀釋倍數的抗血清50 μL/孔，在37 ℃孵育30min，洗滌3次，拍干”。

1.2.8間接ELISA法測定抗體交叉反應率用間接競爭ELISA法測抗體的交叉反應率。采用“1.2.6”節(jié)所確定的最佳包被濃度和抗體稀釋度，將“間接競爭ELISA法”中的第三步替換為“分別加入系列稀釋的氯霉素、甲砜霉素或喹乙醇標準品50 μL/孔和最佳稀釋倍數的抗血清50 μL/孔，在 37 ℃ 孵育30 min，洗滌3次，拍干”。

2結果與分析

2.1紫外掃描結果鑒定

由圖3、圖4可以看出，FFA-BSA和FFA-OVA的紫外吸收光譜不同于FFA、BSA和OVA的紫外吸收光譜。FFA在266、273 nm處有2個吸收峰，最大吸收峰在266 nm處；而BSA、OVA的最大吸收峰分別在278、279 nm處；與FFA、BSA和OVA相比，偶聯物FFA-BSA和FFA-OVA的吸收曲線發(fā)生了變化，最大吸收峰分別為274、270 nm，且在FFA和BSA、OVA的最大吸收范圍內，說明半抗原與載體蛋白偶聯成功，這與趙朋玲等的報道[15]一致。

2.2人工抗原結合比

結合FFA、載體蛋白及人工抗原的紫外吸收數據計算出FFA-BSA和FFA-OVA的結合比，分別為12 ∶1和11 ∶1。經研究發(fā)現，載體蛋白與連接的半抗原分子數量在 1 ∶（5～25）[22]的范圍內能獲得良好的免疫效果。比例過低，會因空間屏蔽作用阻礙抗原抗體的免疫反應而降低檢測的靈敏度；比例過高，則會增加偶聯物制備過程中的麻煩，且會降低免疫誘導質量[20]。本試驗合成的免疫原結合比為12 ∶1，正好在這個范圍內，說明合成的免疫原有較好的免疫效果。

2.3最佳包被濃度的確定

選擇D值隨包被濃度降低而突然降低且在1.0左右的那一點的包被濃度，由表1可知，最佳包被濃度為2 μg/mL。

2.4血清效價的測定

由表2可知，經過多次免疫后，6只小鼠的效價均在 32 000 以上，說明注射的抗原均達到了良好的免疫效果，也驗證了人工抗原偶聯成功。

2.5抗體敏感性測定

圖5為氟苯尼考對抗體的抑制率標準曲線。該曲線呈“S”形，與Luo等的報道[2]相似。曲線中間線性部分的線性回歸方程為y=-0.372 8x+1.084 3，r2=0.994 4。根據回歸方程計算出半抑制率（IC50，是抑制率為50%時所對應的藥物濃度，IC50越低，說明抗體的特異性越強）為36.9 ng/mL。由圖5可知，該抗體與氟苯尼考表現出很好的親和性。

2.6抗體交叉反應率的測定

由表3可知，制備的抗體與結構相似的甲砜霉素有較小的交叉反應，與氯霉素、結構不相似的喹乙醇幾乎無交叉反應。

3結論與討論

3.1氟苯尼考人工抗原的制備和鑒定

免疫識別要求免疫原至少要有2個識別位點，因此免疫原分子必須相當大，所以小分子物質（分子量<2 500[23]）不能產生免疫應答[20]。氟苯尼考分子量為358.22，屬于小分子物質，必須與大分子物質偶聯才能使動物機體產生免疫反應。由于氟苯尼考在結構上既無羧基又無氨基，必須先進行結構改造，才能與蛋白偶聯。但改造時須盡可能保留其特征結構，并引入合適的間隔臂和與載體蛋白偶聯的活性基團。常用的改造方法有[15]：一是利用FF分子上所帶的羥基合成含CO—NH鍵的抗原；二是用強堿水解氟苯尼考分子為氟苯尼考胺，再與含醛基的物質、載體蛋白的氨基以共價鍵相連。本試驗選用戊二醛一步法，氟苯尼考胺為半抗原合成人工抗原，操作簡單、易行。載體蛋白的選擇也是抗原合成的重要因素，本試驗選擇BSA作為免疫原的載體，OVA作包被原的載體，它們的親緣性較遠，可以減少和避免交叉反應，且都價廉易得[24]。endprint

用于人工抗原的鑒定方法有很多，包括紫外光譜法[18]、紅外光譜法[24]、SDS-PAGE電泳[21]、基質輔助激光解析質譜法[21]及免疫鑒定分析[15，25]等。其中，紫外光譜法最簡便、快速且不會消耗樣品[20]，所以常被使用。本研究用紫外光譜法對人工抗原、半抗原與載體蛋白紫外吸收光譜特征進行鑒定，其吸收峰出現了平移，說明人工抗原合成成功；并根據吸光度計算出其分子中半抗原與載體的分子結合比率，分別為 12 ∶1、11 ∶1。另外，多克隆抗體的成功制備也驗證了人工抗原的合成成功。

3.2FF多克隆抗體的制備及鑒定

人工制備的抗體可分為單克隆抗體和多克隆抗體。前者由于生產成本高、試驗周期長、技術和條件要求苛刻，所以本研究選擇制備多克隆抗體。多克隆抗體存在于免疫動物的血清中，一般多用兔子作為免疫動物，這樣可以獲得足夠的血清。由于本研究僅需少量抗體，且小鼠飼養(yǎng)方便、成本低、操作方便，少量的免疫原即可產生免疫應答反應，所以本研究選用6周齡清潔級BALB/C小鼠為免疫動物[26]。

免疫劑量和免疫方式對免疫效果和抗體效價具有較大的影響，一般認為1 kg體質量1次免疫1 mg左右的半抗原-蛋白質免疫原[20]，免疫劑量過低不會發(fā)生免疫反應，而過高的免疫原又會產生免疫耐受。本試驗選用100 μg/（只·次）的注射劑量，該劑量在Erhard等認為的最佳免疫劑量范圍內[27]。免疫方式的選擇決定了抗原的吸收、分布和代謝速度，常用的免疫方式有背部皮下多點免疫、腹腔、皮內、肌肉、靜脈、脾臟和淋巴結免疫等。一般認為，小分子物質合成的人工抗原適合背部皮下多點免疫[22]。

本試驗對制備的抗血清進行純化、分析，獲得了氟苯尼考的多克隆抗體，結果顯示該抗體有較高的特異性和靈敏性，IC50值達到36.9 ng/mL，能夠滿足建立快速檢測試紙條的要求[28-29]，可用于下一步試驗。

本試驗將氟苯尼考的改造體氟苯尼考胺與BSA和OVA合成人工抗原，經紫外掃描鑒定，證明人工抗原合成成功。用其制備的多克隆抗體，測得IC50為36.9 ng/mL，與氟苯尼考有良好的親和性和特異性，為進一步研究動物源食品中氟苯尼考殘留快速檢測技術奠定基礎。

參考文獻：

[1]Schwarz S，Kehrenberg C，Doublet B，et al. Molecular basis of bacterial resistance to chloramphenicol and florfenicol[J]. FEMS Microbiology Reviews，2004，28（5）：519-542.

[2]Luo P J，Jiang H Y，Wang Z H. Simultaneous determination of florfenicol and its metabolite florfenicol amine in swine muscle tissue by a heterologous enzyme-linked immunosorbent assay[J]. Journal of AOAC International，2009，92（3）：981-988.

[3]陳曉慧，劉明春，焦陽. 氟苯尼考的研究新進展及其應用[J]. 現代畜牧獸醫(yī)，2006（10）：51-54.

[4]李瑩瑩，宋永青，趙榕，等. 液質聯用檢測魚肉中氟苯尼考和氟苯尼考胺的殘留量[J]. 食品科學，2010，31（12）：219-222.

[5]謝愷舟，徐東，陳書琴，等. 高效液相色譜熒光檢測法同時檢測雞肉中甲砜霉素、氟苯尼考及氟苯尼考胺殘留[J]. 分析試驗室，2011，30（7）：31-35.

[6]Wrzesinski C L，Crouch L S，Endris R. determination of florfenicol amine in channel catfish muscle by liquid chromatography[J]. Journal of AOAC International，2003，86（3）：515-520.

[7]孫豐云，張素霞，沈建忠，等. 蝦肉中氯霉素甲砜霉素氟苯尼考及氟苯尼考胺殘留氣相色譜-微電子捕獲檢測法[J]. 中國獸醫(yī)雜志，2006，42（10）：66-68.

[8]賀利民，曾振靈，黃顯會，等. 氣相色譜-質譜聯用法測定豬肉組織中氟苯尼考殘留[J]. 華南農業(yè)大學學報，2005，26（3）：100-102.

[9]張鳳清，王巖松，范世華，等. 高效液相色譜-串聯質譜法測定動物肌肉組織中氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考殘留量[J]. 食品科學，2010，31（8）：248-251.

[10]Zhang S X，Liu Z W，Guo X，et al. Simultaneous determination and confirmation of chloramphenicol，thiamphenicol，florfenicol and florfenicol amine in chicken muscle by liquid chromatography-tandem mass spectrometry[J]. Journal of Chromatography B：Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences，2008，875（2）： 399-404.

[11]Luo P J，Jiang W X，Chen X，et al. Technical note：development of an enzyme-linked immunosorbent assay for the determination of florfenicol and thiamphenicol in swine feed[J]. Journal of Animal Science，2011，89（11）： 3612-3616.endprint

[12]Fodey T L，George S E，Traynor I M，et al. Approaches for the simultaneous detection of thiamphenicol，florfenicol and florfenicol amine using immunochemical techniques[J]. Journal of Immunological Methods，2013，393（1/2）：30-37.

[13]孔繁德，黃印堯，賴清金. 免疫膠體金技術及其發(fā)展前景[J]. 福建畜牧獸醫(yī)，2002，24（增刊）：42-43，45.

[14]Shi C G，Zhao S Q，Zhang K，et al. Preparation of colloidal gold immunochromatography strip for detection of methamidophos residue[J]. Journal of Environmental Sciences，2008，20（11）：1392-1397.

[15]趙朋玲，鄭海濤，姜盼盼，等. 兩種方法制備氟苯尼考人工抗原及其鑒定[J]. 食品科學，2010，31（15）：225-230.

[16]趙津子. 氟苯尼考胺IgY抗體的制備及ELISA檢測方法的建立[D]. 楊凌：西北農林科技大學，2012.

[17]Sheng J W，He M，Shi H C，et al. A comprehensive immunoassay for the detection of microcystins in waters based on polyclonal antibodies[J]. Analytica Chimica Acta，2006，572（2）：309-315.

[18]Liu J，Zhang H C，Zhang D S，et al. Production of the monoclonal antibody against Sudan 2 for immunoassay of Sudan dyes in egg[J]. Analytical Biochemistry，2012，423（2）：246-252.

[19]侯吉波，丁再棣，何家惠.介紹一種簡便的抗原乳化方法[J]. 上海免疫學雜志，1990（4）：216.

[20]楊利國，胡少昶，魏平華，等. 酶免疫測定技術[M]. 南京：南京大學出版社，1998.

[21]王瑩，鄭浩，何成華，等. 伏馬菌素B1單克隆抗體的制備及鑒定[J]. 中國農業(yè)科學，2011，44（20）：4302-4308.

[22]宋春美. 喹乙醇單克隆抗體的制備及其免疫學快速檢測方法的建立[D]. 洛陽：河南科技大學，2009.

[23]張明洲，胡華軍，楊嶺，等. 蘇丹紅Ⅰ號多克隆抗體的制備與特異性鑒定[J]. 中國計量學院學報，2008，19（2）：170-173，182.

[24]朱學加，陳金蘭，何計國. 喹乙醇人工抗原的合成及鑒定[J]. 食品科學，2008，29（5）：129-133.

[25]趙啟法，張改平，職愛民，等. 頭孢氨芐人工抗原的合成及多克隆抗體的制備[J]. 西北農業(yè)學報，2012，21（7）：20-24，90.

[26]胡珩. 氟喹諾酮多組分殘留檢測試紙條的研制[D]. 長春：吉林大學，2008.

[27]Erhard M H，Ozpinar H，Bilal T，et al. The humoral immune response and the productivity of laying hens kept on the ground or in cages[J]. Alternatives to Laboratory Animals，2000，28（5）： 699-705.

[28]Xu C L，Chu X G，Peng C F，et al. Comparison of enzyme-linked immunosorbent assay with liquid chromatography-tandem mass spectrometry for the determination of diethylstilbesterol residues in chicken and liver tissues[J]. Biomedical Chromatography，2006，20（10）：1056-1064.

[29]Xu C L，Wang H T，Peng C F，et al. Colloidal gold-based immumochromatographic assay for detection of diethylstilbestrol residues[J]. Biomedical Chromatography，2006，20（12）：1390-1394.徐婷，崔占鴻，鐘瑾，等. 青海省部分地區(qū)人工種植燕麥青貯乳酸菌的篩選[J]. 江蘇農業(yè)科學，2015，43（2）：205-208.endprint