王康華，程 遠(yuǎn)，宮緒萌，康利民，洪 合，高 毅，潘明新△

（南方醫(yī)科大學(xué)：1.珠江醫(yī)院肝膽二科；2.器官衰竭防治國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；3.器官衰竭防治協(xié)同創(chuàng)新中心，廣州510282）

最近幾年在組織工程和再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域出現(xiàn)一些明顯進(jìn)步，有功能的組織和器官已經(jīng)在體外被創(chuàng)造，并且成功地被移植入受體。一些工程性組織及器官例如血管[1]、膀胱[2]及角膜[3]已有了明顯的進(jìn)步。以上的這些器官結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，然而像肝臟、腎臟、肺及心臟等成分、結(jié)構(gòu)復(fù)雜，人工合成的支架材料難以模仿。對(duì)于大型并具有復(fù)雜結(jié)構(gòu)的器官，以灌注為基礎(chǔ)的去細(xì)胞方法已成功應(yīng)用于心臟[4]、肝臟[5-7]、肺[8]及腎臟[9]，這種方法不僅能夠去除細(xì)胞及核性物質(zhì)并避免了潛在的免疫反應(yīng)的發(fā)生，還保留三維的細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)及完整的脈管系統(tǒng)，提供了細(xì)胞生長(zhǎng)和功能表達(dá)的最自然微環(huán)境。

目前，對(duì)于不同種屬的肝臟已有多種灌注去細(xì)胞方法應(yīng)用于制備肝臟去細(xì)胞支架（decellularized liver biological scaffold，DLBS），主要以十二烷基硫酸鈉（SDS）和Triton X-100在去細(xì)胞過程中的應(yīng)用最為廣泛。其中，1%Triton X-100已廣泛應(yīng)用于各種器官和組織的去細(xì)胞化[10]。而對(duì)于SDS，根據(jù)已報(bào)道文獻(xiàn)SDS使用濃度可從0.1%～5%[9]。這些去細(xì)胞方法流程、效果各有不同，難以統(tǒng)一。因此，作者使用了低濃度SDS（0.5%SDS、0.25%SDS）及1%Triton X-100均以5mL／min的灌注流速對(duì)大鼠肝臟進(jìn)行脫細(xì)胞，比較三者對(duì)于大鼠DLBS的影響，從而確立一種耗時(shí)短且非常有效的大鼠肝臟去細(xì)胞方法。

1 材料與方法

1.1 材料 SPF級(jí)2月齡SD大鼠20只（雌雄不限），體質(zhì)量約200～300g，購自本校實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心（合格證號(hào)：粵2013-0002），Triton X-100（美國(guó)Sigma公司），SDS（上?；瘜W(xué)試劑公司），DNA酶（美國(guó)Sigma公司），羊抗大鼠Ⅰ型膠原蛋白多克隆抗體（Santa Cruz），兔抗大鼠Ⅳ型膠原蛋白多克隆抗體（武漢博士德生物工程有限公司），羊抗大鼠彈性蛋白多克隆抗體（Santa Cruz），羊抗大鼠層粘連蛋白多克隆抗體（Santa Cruz），兔抗大鼠纖維粘連蛋白多克隆抗體（武漢博士德生物工程有限公司），倒置熒光顯微鏡（Leica，DMI6000B），DNA提取試劑盒（Qiagen，Valencia，CA），DNA定量試劑盒（Invitrogen，Carlsbad，CA），GAGs定量試劑盒（Biocolor，Belfast，UK），超級(jí)酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀（Model 680，Bio-Rad，US），掃描電子顯微鏡（Fei Qusnta 200）。

表1 3組的灌注去細(xì)胞的過程

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物及肝臟的獲取 將大鼠分為4組，每組5只，包含3個(gè)實(shí)驗(yàn)組和1個(gè)對(duì)照組。所有大鼠均腹膜下注射麻醉；大鼠麻醉后，按以下步驟操作：（1）打開腹腔，游離肝周韌帶；（2）游離門靜脈，并經(jīng)門靜脈插管固定后灌注500mL沖洗液（1×PBS、0.02%EDTA和2mL肝素鈉）；（3）切斷下腔靜脈，將其作為液體流出道灌注后；（4）將肝臟移至大鼠體外，將行灌注去細(xì)胞。

1.2.2 大鼠肝臟去細(xì)胞 將去細(xì)胞液通過已插好的管道灌入肝臟內(nèi)；具體各組的灌注去細(xì)胞的過程見表1。

1.2.3 免疫熒光 每組取1個(gè)樣本，用4%多聚甲醛固定12h；將樣本包埋，將樣本切成厚度為5μm薄片，將其黏附在載玻片上；進(jìn)行熒光分析前，用二甲苯脫蠟2次；接著依次經(jīng)梯度乙醇及純水進(jìn)行脫水。用PBS沖洗，將樣本浸泡在檸檬酸溶液中，再用1×PBS洗3次。用10%正常山羊血清在室溫下封閉樣本30min；用一抗在4℃環(huán)境下孵育過夜；熒光標(biāo)記二抗在室溫下濕盒避光封閉孵育1h；4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）室溫下濕盒避光封閉孵育5min；抗熒光淬滅劑封片，用倒置熒光顯微鏡拍片。

1.2.4 DNA定量實(shí)驗(yàn) 將正常肝臟組織和去DLBS切成小片，放入離心管，進(jìn)行凍干，再稱好各組樣本質(zhì)量（n＝5），對(duì)樣本進(jìn)行消化，蛋白沉淀后，將蛋白去除，用DNeasy Tissue kit按照操作說明對(duì)樣本進(jìn)行DNA提取；接著用Quant-iT PicoGreen dsDNA assay按照操作說明對(duì)樣本DNA水平進(jìn)行定量；根據(jù)DNA定量的標(biāo)準(zhǔn)曲線，測(cè)定樣本DNA水平。

1.2.5 GAGs定量實(shí)驗(yàn) 使用Blyscan GAG assay kit對(duì)GAGs進(jìn)行定量。將樣品冷凍干燥（n＝5），稱質(zhì)量，然后在65℃的環(huán)境下用木瓜蛋白酶孵育（150μg／mL）。取上清液放入1.5mL EP管中。添加Blyscan染料試劑后，離心10min。用分離劑將離心后的沉淀進(jìn)行溶解，讀取650nm處的吸光（A）值。

1.2.6 掃描電子顯微鏡觀察DLBS微觀形態(tài) 用2.5%戊二醛將少量DLBS固定24h，并保存在4℃冰箱內(nèi)；然后用加入乙醇逐級(jí)梯度脫水。加入醋酸異戊酯，將乙醇置換出來，再加入純醋酸異戊酯將樣本浸泡，干燥樣本，將樣本均勻噴鍍金屬。再用掃描電子顯微鏡觀察樣本。

圖1 各處理組的灌注過程圖

1.2.7 MTT檢測(cè)DLBS對(duì)C3A細(xì)胞增殖的影響 按DMEM培養(yǎng)液與DLBS之比為1mL／mg加入DMEM培養(yǎng)液（10%FBS），于37℃下靜置24h制備浸提液，取一代生長(zhǎng)良好的C3A細(xì)胞，稀釋成2×103個(gè)細(xì)胞／mL，接種到3塊96孔板上，每塊板上接種4組，每組5孔，每孔200μL，于5%CO2培養(yǎng)箱中37℃下培養(yǎng)24h，棄原培養(yǎng)液，對(duì)照組加新配制的含10%FBS的DMEM 100μL，實(shí)驗(yàn)組分別加各處理組樣品浸出液100μL，置培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，于1、3、5d各取出1塊培養(yǎng)樣板，每孔加入5mg／mL的 M TT 20μL，繼續(xù)培養(yǎng)4h，倒出培養(yǎng)液，再加150μL二甲基亞砜，振蕩10min，酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上以490nm波長(zhǎng)測(cè)吸收值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 15.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以±s表示，采用one-way ANOVA判斷各處理組與對(duì)照組有無差異，各處理組的差異性采用SNK檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠肝臟的灌注去細(xì)胞 以0.25%SDS、0.50%SDS、1%Triton X-100灌注的肝臟在灌注2h后大鼠肝臟均成功地去細(xì)胞，產(chǎn)生了全肝臟細(xì)胞支架，并呈現(xiàn)透明外觀，包膜完整，保留了肝臟的形態(tài)，肉眼可見包膜內(nèi)的Glisson系統(tǒng)保存（圖1）。各組殘留DNA定量（圖2），0.25%SDS、0.50%SDS及1%Triton X-100處理組的DNA殘留量為（46.14±6.08）ng／mg、（40.89±6.73）ng／mg、（64.07±5.99）ng／mg。0.25%SDS組和0.50%SDS組的DNA定量小于50ng／mg（干質(zhì)量）；另外，各處理組的殘留DNA量?jī)H為對(duì)照組DNA量（2 546.81±526.39）ng／mg的2%～3%。各處理組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.2 DLBS成分的免疫熒光分析 通過免疫熒光，可以展現(xiàn)細(xì)胞外基質(zhì)中的5種蛋白成分在DLBS中的分布（圖3）。在所有樣本，可見Collagen-Ⅰ的陽性標(biāo)記廣泛存在于細(xì)胞外基質(zhì)，主要位于肝小葉之間的纖維連接組織中。Collagen-Ⅳ則位于正常肝臟中內(nèi)大管道，在以上3種去細(xì)胞方法處理組中可見Collagen-Ⅳ陽性標(biāo)記存在于細(xì)胞外基質(zhì)中一些保持著血管結(jié)構(gòu)的區(qū)域。Fibronection在熒光圖片中與Collagen-Ⅰ陽性標(biāo)記區(qū)位置大致相同；而elastin與lamininα-2的陽性標(biāo)記可見于一些較大的管道周圍。

2.3 GAGs定量分析 GAGs在0.25%SDS處理組、0.50%SDS處理組、1%Triton X-100處理組干質(zhì)量分別為（4.05±0.77）μg／mg、（3.12±0.68）μg／mg、（4.25±0.54）μg／mg，約為正常肝臟GAGs水平[（8.16±0.28）μg／mg]的50%左右，0.25%SDS處理組和1%Triton X-100處理組的GAGs定量高于0.50%SDS處理組（P＜0.05），前兩組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見圖2。

圖2 各組殘留DNA定量圖

圖3 各組正常大鼠肝臟和去細(xì)胞肝臟組織的5種蛋白的免疫熒光染色

圖4 掃描電子顯微鏡下顯示各處理組影像

2.4 掃描電子顯微鏡觀察 電子顯微鏡顯示在DLBS中可見包含著包膜和脈管結(jié)構(gòu)的三維的細(xì)胞外基質(zhì)微結(jié)構(gòu)，可見一些管道系統(tǒng)的存在（圖4）。但1%TritonX-100處理組可見DLBS內(nèi)的膠原纖維排列較為松散，而0.25%SDS處理組和0.50%SDS處理組內(nèi)的膠原纖維排列更為緊湊。

2.5 MTT實(shí)驗(yàn) 體外細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。0.25%SDS處理組、0.50%SDS處理組、1%Triton X-100處理組與對(duì)照組在1、3、5d的A值比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表2 各組在MTT實(shí)驗(yàn)的第1、3、5天的A值比較（±s）

表2 各組在MTT實(shí)驗(yàn)的第1、3、5天的A值比較（±s）

組別 第1天 第3天 第5天0.201±0.009 0.376±0.008 0.517±0.004 0.25%SDS處理組0.192±0.007 0.378±0.012 0.515±0.006 0.50%SDS處理組0.190±0.014 0.373±0.011 0.512±0.009 1%Triton X-100處理組對(duì)照組0.191±0.015 0.377±0.012 0.514±0.007

3 討論

本研究按照既往文獻(xiàn)中的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)價(jià)0.25%SDS、0.50%SDS及1%Triton X-100的去細(xì)胞效果，標(biāo)準(zhǔn)包括：（1）有效地去除肝臟內(nèi)細(xì)胞物質(zhì)（DNA水平≤50ng／mg）[11]；（2）肝臟去細(xì)胞后的超微結(jié)構(gòu)和細(xì)胞外基質(zhì)成分的保留[12]；（3）體外細(xì)胞培養(yǎng)的毒性實(shí)驗(yàn)[9]。

所有的方法均能很大程度地降低去細(xì)胞肝臟的DNA水平，0.25%SDS和0.50%SDS處理后大鼠肝臟的DNA水平達(dá)到作者設(shè)定的標(biāo)準(zhǔn)，這兩組DNA水平的平均值低于50ng／mg干質(zhì)量。假設(shè)去細(xì)胞肝臟應(yīng)用于臨床移植，其殘留的DNA可能做為引起免疫排斥反應(yīng)的潛在因素，因此，對(duì)于DNA水平這項(xiàng)標(biāo)準(zhǔn)就顯得尤為重要[13]。

細(xì)胞外基質(zhì)的基礎(chǔ)性的超微結(jié)構(gòu)和本身的蛋白的保留則是第2個(gè)評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，而以上2個(gè)方面恰恰是以目標(biāo)細(xì)胞重建功能器官所必須。在保留sGAG方面，由于sGAG能保護(hù)游離生長(zhǎng)因子以免受到蛋白降解，并且在去細(xì)胞化細(xì)胞外基質(zhì)的再細(xì)胞化過程中對(duì)細(xì)胞黏附、形態(tài)改變及運(yùn)動(dòng)性和細(xì)胞原始表型保持有著重要的作用[11]，從這2個(gè)方面看，顯然0.25%SDS處理組和1%Triton X-100處理組較其他組對(duì)支架的再細(xì)胞可能更有優(yōu)勢(shì)。

另外，為了進(jìn)一步研究這些DLBS是否能夠支持細(xì)胞的生長(zhǎng)，同時(shí)觀察是否有可溶性毒性物質(zhì)存在于其中。作者通過MTT實(shí)驗(yàn)觀察細(xì)胞在不同處理組的支架浸出液中的生長(zhǎng)情況。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，各處理組的細(xì)胞生長(zhǎng)基本呈現(xiàn)一個(gè)持續(xù)增加的趨勢(shì)?？傮w上，經(jīng)0.25%SDS、0.50%SDS及1%Triton X-100等處理組DLBS是能夠維持細(xì)胞的黏附和生長(zhǎng)，并未留下任何不利于細(xì)胞生長(zhǎng)和繁殖的毒性物質(zhì)。

以0.25%SDS處理的DLBS在這3個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的評(píng)定中，較其他處理組具備一定優(yōu)勢(shì)，這不支持之前的一些認(rèn)為SDS對(duì)去細(xì)胞化細(xì)胞外基質(zhì)的破壞劇烈的觀點(diǎn)[14-15]。說明以低濃度SDS灌注去細(xì)胞后，同樣能夠完全去除細(xì)胞及核性物質(zhì)，并最小化地破壞細(xì)胞外基質(zhì)的結(jié)構(gòu)和成分。

本研究證明了低濃度SDS即0.25%SDS有良好的去細(xì)胞效果，同時(shí)確立了一個(gè)有效且快速的大鼠肝臟去細(xì)胞方法，為以后支架的細(xì)胞再灌注及體內(nèi)移植奠定基礎(chǔ)。

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