張建軍，薛科邦，何茂昌，徐建峰，趙生國，白雅琴，王耀榮，謝文章

（1.甘肅省畜牧獸醫(yī)研究所，甘肅，平?jīng)?44000；2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院；

3.華池縣畜牧獸醫(yī)站；4.環(huán)縣畜禽改良站）

生長激素（growth hormone，GH）是由動物垂體前葉分泌的一種蛋白類激素，它具有廣泛的生理功能，能影響蛋白質(zhì)、脂肪、糖類三大物質(zhì)的代謝。GH 基因存在單核苷酸多態(tài)性，與動物的體重、產(chǎn)奶量、產(chǎn)絨量等部分經(jīng)濟性狀具有一定關(guān)聯(lián)性，可以作為影響生長發(fā)育性狀的重要候選基因進(jìn)行分子標(biāo)記輔助選擇。隴東絨山羊是經(jīng)30年培育的地方優(yōu)良品種，具有體質(zhì)結(jié)實、體型外貌一致、遺傳性穩(wěn)定、耐粗飼、抗病力強等優(yōu)點，已成為隴東地區(qū)養(yǎng)殖的主導(dǎo)山羊群體。為了充分保護和開發(fā)利用隴東絨山羊優(yōu)良的遺傳資源，本研究采用PCR－SSCP 方法，以隴東絨山羊為研究對象，對GH 基因第一外顯子和第四外顯子進(jìn)行多態(tài)性分析，研究隴東絨山羊生長激素（growth hormone，GH）基因遺傳多態(tài)性，旨在尋找與生產(chǎn)性能相關(guān)的SNPs位點，為后期開展分子標(biāo)記輔助選擇，加快新品種選育進(jìn)展提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗動物 從華池縣悅樂絨山羊繁育中心、環(huán)縣惠農(nóng)絨山羊發(fā)育基地隨機選擇隴東絨山羊160只，作為試驗動物。從羊頸靜脈采血，加入ACD 抗凝劑后帶回實驗室，－20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 主要試劑 Taq DNA 聚合酶、蛋白酶K、dNTP購自寶生物工程（大連）有限公司；pGEM－T載體及T4DNA Ligase購自Promega公司；質(zhì)粒提取試劑盒（TIANprep Mini）和凝膠回收試劑盒（TIAN－gel Mini）購自天根生化科技（北京）有限公司。

1.2 方法

1.2.1 血液基因組DNA 的提取 參照酚－氯仿抽提法從凍存血樣中提取基因組DNA，－20 ℃保存，然后用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA。

1.2.2 引物設(shè)計及PCR 擴增 參照GenBank登陸的山羊序列（D00476），利用Primer Premier 5 軟件分別在GH 基因第1外顯子（Exon1）和第4外顯子（Exon4）處各設(shè)計一對引物，由寶生物工程（大連）有限公司合成。引物序列、擴增區(qū)域及PCR 產(chǎn)物的大小見表1。

表1 引物序列、PCR 產(chǎn)物的大小及擴增區(qū)域

PCR 擴增反應(yīng)體系為25μL，包括：10×PCR buffer（15 mmol Mg2＋）2.5 μL；dNTPs（各2.5 mmol）1.6μL；引物混合物（10μm）2.0μL；Taq DNA 聚合酶（5 U／μL）0.2μL；DNA 模板（50ng／μL）1.0μL；其余用超純水補齊至25μL。2 對引物的PCR 擴增 條 件：95 ℃預(yù) 變 性5 min；94 ℃變 性45s，X℃（引物GH－1、GH－2的退火溫度依次為55 ℃、58 ℃）退火45sec，72 ℃延伸1min，共35個循環(huán)；最后72 ℃延伸8min；4 ℃保存。PCR 產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，GoldView （GV）染色檢測結(jié)果。

1.2.3 SSCP分析 取2μL PCR 產(chǎn)物與8μL 變性緩沖液（98%甲酰胺、10mmol／L EDTA、0.025%溴酚蘭、0.025% 二甲苯青），98℃變性10 min，置于冰水浴中5min，上樣于濃度為8%、交聯(lián)度為39∶1（引物Exon4）和濃度為14%、交聯(lián)度為49∶1（引物Exon1）的非變性聚丙烯酰胺凝膠中；在4℃、250v的條件下預(yù)電泳20min，然后恒溫恒壓過夜；電泳結(jié)束后用銀染法染色顯影，直至出現(xiàn)清晰的條帶，用紫外成像儀觀察成像。

1.2.4 克隆測序 經(jīng)SSCP 分析后，將不同基因型純合型個體的PCR 產(chǎn)物用柱式膠回收試劑盒回收純化，用PGM－T 載體連接，JM109 菌株轉(zhuǎn)化，提取重組質(zhì)粒作為測序模板送至上海桑尼生物公司進(jìn)行測序，應(yīng)用BioEdit生物軟件進(jìn)行序列分析。

2 試驗結(jié)果

2.1 PCR－SSCP檢測結(jié)果

引物Exon1和Exon4擴增后到與理論大小一致的特異條帶（見圖1和圖2），且無任何非特異性條帶，可直接進(jìn)行后續(xù)SSCP檢測分析。

圖1 Exon1 位點2%瓊脂糖檢測結(jié)果

圖2 Exon4 位點2%瓊脂糖檢測結(jié)果

從圖3可以看出，Exon1位點不存在SSCP 多態(tài)性，均為野生型。從圖4可以看出，Exon2位點存在SSCP多態(tài)性，產(chǎn)生G、H 兩個等位基因，具有3種基因型，依次命名為GG、HH、GH。

圖3 Exon1 位點PCR－SSCP結(jié)果

圖4 Exon4 位點PCR－SSCP結(jié)果

2.2 序列分析

以序列D00476為參照，利用BioEdit軟件進(jìn)行序列比對，結(jié)果表明，Exon4位點，HH 型與GG型相比，在D00476序列1450bp處發(fā)生了C→T 的單堿基突變（見圖5、圖6）。Exon1位點，HH 型與GG 型堿基序列一致，未出現(xiàn)堿基突變、缺失、插入等。

圖5 Exon4位點GG 基因型核苷酸序列

圖6 Exon4位點HH 基因型核苷酸序

2.3 基因型頻率和等位基因頻率

從2可以看出，Exon4位點，隴東絨山羊群體中以等位基因G 為主，基因頻率為0.575；基因型頻率以GG 最高，HH 次之，GH 最低。

表2 Exon4位點基因頻率和基因型頻率分析

3 討論

隴東絨山羊作為優(yōu)良地方品種，選育歷史悠久，于1984年被列入《甘肅省畜禽品種志》。近年來，隴東地區(qū)將養(yǎng)殖隴東絨山羊作為一項富民產(chǎn)業(yè)來抓，致力于純種保護和羊絨等產(chǎn)品開發(fā)，取得了一定成績。但品種選育工作僅僅局限于傳統(tǒng)育種層面，還未利用分子生物學(xué)手段對影響隴東絨山羊重要經(jīng)濟性狀的的功能基因及多態(tài)位點進(jìn)行深入研究，影響了優(yōu)質(zhì)高效絨山羊新品種（品系）的選育進(jìn)程。本研究首次采用PCR－SSCP方法對隴東絨山羊的GH基因多態(tài)性進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)在Exon4位點1450bp處發(fā)生了C→T 的單堿基突變，這可能與隴東絨山羊在長期選育過程中引入內(nèi)蒙絨山羊、遼寧絨山羊等外來品種進(jìn)行級進(jìn)雜交，造成群體遺傳結(jié)構(gòu)變化有關(guān)。胡沈榮等在關(guān)中奶山羊、陜南白山羊等山羊品種GH 基因外顯子Ⅴ、5′調(diào)控區(qū)也檢測到SNPS位點，這與本試驗結(jié)果類似。此外，Exon4位點突變產(chǎn)生了GG、HH、GH 三種基因型，且基因型以GG型為主這與向德、閔令江等報道的研究結(jié)果有相似之處，但白文林、李中原等研究發(fā)現(xiàn)，在山羊GH 基因僅檢測到兩種基因型，這可能與由于樣本含量、檢測位點、選育環(huán)境等不同有關(guān)，尚有待于進(jìn)一步研究。

尋找影響家畜生產(chǎn)性能的遺傳標(biāo)記是當(dāng)前家畜遺傳育種的主要目的，而候選基因法則是實現(xiàn)這一目的的重要手段。本研究進(jìn)一步驗證了GH 基因在隴東絨山羊上存在遺傳多態(tài)性，今后，應(yīng)尋找更多影響隴東絨山羊生產(chǎn)性能的相關(guān)候選基因及多態(tài)性位點，并在此基礎(chǔ)上開展生產(chǎn)性能相關(guān)性分析，以便更好地為隴東絨山羊遺傳資源的保護和開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

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