高瑞娜，張 婷

（1.朔州職業(yè)技術學院生物工程系，山西 朔州036000；2.新鄉(xiāng)醫(yī)學院三全學院生命科學技術學院）

近年來我省牛人畜共患病呈回升趨勢，布病老疫區(qū)死灰復燃，新疫區(qū)不斷出現(xiàn)，疽、牛結核病和布病還危害其它動物，一旦出現(xiàn)只能撲殺，這不但給我省北部地區(qū)牛羊養(yǎng)殖業(yè)帶來了巨大的損害，還可以通過各種途徑傳染給人，人們飲用未經消毒的病牛奶就可被傳染結核病和布病并引起流行。所以這幾種人獸共患病的存在嚴重威脅著人類的健康，而人畜的交叉?zhèn)鞑t造成了它們的廣泛流行。因此，對引起這些感染的細菌正確快速的鑒別極為重要。

傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)及血清學檢測方法費時繁瑣，導致檢測不及時，靈敏度不夠。近年來，檢測方法在不斷的進步，特別是基于聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）的分子診斷法具有快速、靈敏、特異等顯著特點，已成為人畜微生物檢測的新標準。1988 年Chamberlain 首次報道了一種衍生的PCR 方法多重PCR（multiplex－PCR），即不同病原體的特異基因引物加入同一個反應體系中，在一個反應中同時檢測多個病原體靶基因，給臨床疾病診斷和治療提供極大幫助。本研究立志于建立利用多重PCR 方法建立一種同時快速檢測牛布魯氏菌、牛分枝桿菌、炭疽桿菌的方法，可以通過一種檢測一次性檢測出三種最常見的危害較大的人獸共患病，能夠大量節(jié)省人力物力，同時具有很大的實用價值和公共衛(wèi)生意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣本的收集 收集我市古城乳業(yè)奶牛廠患病奶牛的奶液，共30份。

1.1.2 標準品 含有目的基因的pMD18T 重組質粒作為標準品，重組質粒由上海生工（北京）公司提供。

1.1.3 陽性對照 采用104拷貝／μL 標準品作為陽性對照。

1.1.4 陰性對照 采用核酸提取試劑盒中的洗脫液作為陰性對照。

1.1.5 內部控制 針對牛的Rnase P 基因設計引物作為PCR 反應的內控品。

1.2 方法

1.2.1 標本中總核酸的抽提 奶液100μL，采用Magna pure LC robot（Roche Molecular Systems，Mannheim，Germany）試劑盒抽提核酸。操作按照說明書進行。

1.2.2 引物 針對細菌靶基因保守區(qū)設計引物作為特異性引物，再對特異性引物的兩端分別加上通用引物Tag。各種細菌的引物（引物由上海生物工程公司合成）見表1。

1.2.3 多重熒光定量PCR 采用PCR master mix（Roche）試劑盒進行熒光定量PCR，操作按照說明書進行。在Roche480PCR 儀運行PCR 程序，程序如下：50 ℃，2 min；95 ℃5 min；10 個 循 環(huán)（95℃，15s，60 ℃15s，72 ℃15s）；40個循環(huán)（95 ℃15s，74 ℃30s）；之后收集熒光。每份樣本進行2組反應（表2），重復3次。

1.2.4 數(shù)據分析 程序運行完畢，儀器自動給出Ct值，再進行溶解曲線分析。

若內控品Ct值＜35 且溶解曲線呈單峰，則說明樣品質量良好；若內控品Ct值＞35，則需要重新提取樣本。

若陰控品Ct值＞35 且溶解曲線無特異性峰，說明實驗無污染；若陰控品Ct值＜35，說明實驗有污染，需重配制反應體系。

若每組陽控品Ct值都＜35 且出現(xiàn)三個預期Tm 的單峰，則說明反應體系和程序運行良好；若陽控品沒有達到預期的峰，則需要檢查反應體系和程序編輯是否有誤。

每個組與其相對應的陽控品比較，出現(xiàn)對應的峰則說明感染相應細菌，沒有對應的峰說明沒有該對應細菌感染或是感染量非常少達不到檢測下線。

表1 3種病菌靶基因引物

表2 PCR 反應體系

2 結果與分析

2.1 引物驗證

陽性標本均顯示相應特異性產物大小片段，陰性對照無顯著條帶。

圖1 引物PCR 結果驗證圖

2.2 多重熒光定量PCR 檢測體系建立

該檢測體系應用磁珠法提取核酸和多重熒光定量PCR 技術，有效檢測線性范圍為1×101～1×106拷貝／μL，最低檢測限為10 拷貝／μL，陰性對照沒有擴增，說明該方法敏感性和特異性均較高，符合臨床檢測要求。

2.3 多重檢測體系單模板靈敏度及特異性試驗結果

多重檢測體系中，每組反應只加單一模板，按濃度梯度（101～106拷貝／μL）依次加入，每個反應只出現(xiàn)一個特異性溶解曲線，相對應的Tm 值分別為83.29、86.04、88.93，無交叉反應；內控特異性Tm值為91.12。

圖2 多重實時熒光定量PCR 檢測體系靈敏度檢測結果

圖3 多重體系中單模板檢測結果

2.4 多模板靈敏度及特異性試驗結果

將3種標準品等拷貝混合，并梯度稀釋至101～106拷貝／μL，其余反應成分和反應程序不變，3次重復。根據熒光定量信號值大小，進行引物濃度微調整，優(yōu)化檢測體系。

優(yōu)化后的體系檢測結果如圖4，靈敏度為102拷貝／μL，特異性良好，與其他細菌無交叉反應。

2.5 臨床標本檢測驗證體系試驗結果

該檢測體系對臨床樣本（其中炭疽桿菌、牛布魯氏菌或者牛分枝桿菌感染非免疫牛27份）30份奶樣，分別進行細菌分離和PCR 檢測，檢測結果如表3，準確度為100%，陽性檢出率為88.89%，符合臨床檢測要求。

圖4 多重體系中多模板檢測結果

表3 臨床標本檢測結果

3 討論

最早檢測布氏桿菌的基礎PCR 是針對布氏桿菌上高度保守的單個基因（如BCSP31 和6SrRNA基因）而設計的，主要是用于鑒定布氏桿菌種的類型。劉思國等根據已發(fā)表的牛分枝桿菌的pncA 的基因序列，設計和合成了一對可擴增294bp目的片段的引物，建立了特異性檢測牛分枝桿菌的PCR 方法。肖履中等以多個炭疽桿菌菌種為試驗苗對毒力基因tox和cap基因進行了PCR 檢測的研究。這些研究證明PCR 檢測方法對病菌檢測的特異性。

多重熒光定量PCR 因其價廉、快速靈敏等特點而在臨床病原體檢測方面具有巨大的潛在應用價值，國內外也對此方面已開展了大量研究。Weltia等比較了單個熒光定量PCR 和多重熒光定量PCR檢測肺炎衣原體、肺炎支原體和嗜肺軍團菌3種病原體的效果，發(fā)現(xiàn)兩種方法靈敏度相當，但后者明顯具有簡便經濟的優(yōu)勢。陳玉霞等對奶牛常見乳房炎病菌進行特異快速的PCR 檢測方法，實現(xiàn)了奶牛乳房炎準確、快速的診斷。Angela M 等介紹了多重熒光定量PCR 技術在臨床病原體檢測中的應用，其中包括Idaho公司的FilmArray技術，Qiagen公司的RespPlex 技術，韓健等自動化分子檢測平臺。但是，鑒于先進的技術都需要昂貴的儀器或試劑，本研究在前人的基礎上優(yōu)化了檢測體系，能在2h之內同時分別檢測出Bac、My、Br三種病菌，克服了傳統(tǒng)的PCR 檢測時間長；通用引物降低了多重PCR 偏向性擴增、特異性差等問題；熒光信號判讀結果容易，降低了檢測成本。同時，該檢測體系可以擴展，根據需要優(yōu)化3種病原體為一組，在96孔板上檢測種類可多可少，最多可同時檢測幾十種。

但是該檢測體系也存在一些缺陷，由于病原體變異較快，加之有些病原體保守區(qū)非常短，擴增產物只有100－200bp，發(fā)生一兩個堿基的突變都會導致特異性Tm 值變化，影響結果判讀；需不斷優(yōu)化體系。

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