胡宏偉，蔡 元，田 斌，馮海霞，常運朝，張 瑩，車團結(jié)，張成虎，＊

（1.蘭州市畜牧獸醫(yī)研究所，甘肅 蘭州730050；2.甘肅省生物芯片工程實驗室）

奶牛乳腺炎又叫乳房炎，是由機械性刺激、病原微生物入侵及化學物理性損傷等因素所致的危害性很大的疾病，不僅危害著奶牛業(yè)，而且嚴重威脅著人類的健康，奶牛發(fā)病后可引起產(chǎn)奶量和乳品質(zhì)下降，平均每頭牛產(chǎn)奶量降低15%，嚴重者造成奶牛過早的淘汰，給奶業(yè)生產(chǎn)造成很大損失。我國奶牛乳腺炎陽性率在46.4%～85.7%，我國牧場中的乳腺炎80%以上都是由病原微生物引起的，臨床上治療奶牛乳房炎多用抗生素來防治，大量抗生素的濫用使得細菌耐藥性明顯上升。本研究在2014年4月至8月，抽取了甘肅省河東地區(qū)天水市、蘭州市不同縣區(qū)、河西地區(qū)金昌市部分奶牛場的乳腺炎（包括臨床型和隱形乳腺炎）乳樣323 份，采用6%～8%綿羊鮮血瓊脂平板培養(yǎng)基、選擇性培養(yǎng)基（BETA－SSA瓊脂培養(yǎng)基），普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基結(jié)合革蘭染色、鏡檢及生化試驗，分離鑒定出乳樣中的停乳鏈球菌；選用臨床常用的10種抗生素對分離株進行藥敏試驗。分析了甘肅省部分地區(qū)奶牛場乳腺炎停乳鏈球菌對10中常用抗生素的敏感情況和耐藥現(xiàn)狀，旨在為臨床合理用藥提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要儀器 培養(yǎng)箱（南京電器廠生產(chǎn)）、LEICA BME 雙目顯微鏡（德國萊卡儀器有限公司）、超凈工作臺（ZHJH－1112上海智城分析儀器制造有限公司）、高速冷凍離心機（HERMLE，德國）。

1.1.2 培養(yǎng)基與試劑 普通營養(yǎng)瓊脂平板，6%～8%綿羊鮮血瓊脂平板培養(yǎng)基、營養(yǎng)肉湯（10%血清），選擇性培養(yǎng)基（BETA－SSA 瓊脂培養(yǎng)基），革蘭染色液等（青島高科園海博生物技術(shù)有限公司）。

1.1.3 藥敏紙片 慶大霉素、左氧氟沙星、紅霉素、甲砜霉素、四環(huán)素、萬古霉素、環(huán)丙沙星、青霉素、頭孢曲松拉、克林霉素共10種藥敏紙片（杭州微生物試劑有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 乳樣采集 采集甘肅省河西地區(qū)金昌市、蘭州市不同縣區(qū)、河東地區(qū)天水市部分奶牛場的乳腺炎乳樣，每頭目標牛采集一份樣，共計323份。采樣前乳頭按常規(guī)程序消毒，先用干凈水沖洗，再用75%酒精消毒4個奶區(qū)和工作人員的手指，酒精棉球擦干，去前兩把乳汁，每個奶牛取50 mL 乳樣放入離心管內(nèi)，做好標記后放入裝有冰塊的采樣箱里12h內(nèi)送檢。

1.2.2 停乳鏈球菌的分離鑒定 采集的323份乳腺炎乳樣分批以5 000r／min離心15min后，移去管中上層液體，留取離心管底部沉淀物，用無菌生理鹽水稀釋，吸取上述混懸液，接種于營養(yǎng)肉湯（10%血清）中，于37 ℃富集培養(yǎng)24h。將培養(yǎng)物分別劃線接種到普通營養(yǎng)瓊脂平板，6%～8%綿羊鮮血瓊脂平板培養(yǎng)基，BETA－SSA 瓊脂培養(yǎng)基37 ℃培養(yǎng)24h，觀察溶血現(xiàn)象。用接種針挑取BETA－SSA瓊脂培養(yǎng)基上的單個乳白色菌落再次接種到BETA－SSA 瓊脂培養(yǎng)基上純化培養(yǎng)，純化培養(yǎng)后經(jīng)過染色、鏡檢初步確定為疑似停乳鏈球菌后進行CAMP試驗和生化試驗。

1.2.3 CAMP試驗 在血瓊脂平板上用金黃色葡萄球菌培養(yǎng)物劃一條直線，然后將鏈球菌培養(yǎng)物劃一條線，與金黃色葡萄球菌培養(yǎng)物的劃線相互垂直，但不要接觸，二者相距3～5 mm，各鏈球菌分離菌劃線間距10～20mm。置37℃溫箱內(nèi)培養(yǎng)24h后觀察結(jié)果。在兩劃線交界處是否出現(xiàn)箭頭樣的溶血區(qū)，出現(xiàn)為陽性，不出現(xiàn)為陰性。

1.2.4 生化試驗 經(jīng)革蘭氏染色、鏡檢初步鑒定為鏈球菌的純化培養(yǎng)物，根據(jù)屬鏈球菌的生化特征確定鑒定的生化指標。用七葉苷、甘露醇、山梨醇、乳糖、棉子糖、海藻糖，水楊苷、菊糖、馬尿酸鈉、6.5%NaCl試驗、精氨酸水解試驗、溶血試驗等生化指標進行生化鑒定。

1.2.5 藥敏試驗 藥敏試驗嚴格按照臨床試驗標準研究所（CLSI）抗細菌藥物敏感試驗的規(guī)范操作。本實驗選擇紙片擴散法，將上述方法分離的典型菌株用無菌生理鹽水稀釋至約1.5×108CFU／mL（采用細菌計數(shù)法），接種到MH 瓊脂培養(yǎng)基上，每個平板貼上抗生素（寫具體抗生素名稱）藥敏紙片，每張紙片間距不少于24mm，紙片中心距平皿邊緣不少于15mm。菌接種后15min內(nèi)貼完紙片。將平板反轉(zhuǎn)，36±1 ℃孵育18～24h后取出，用游標卡尺測量抑菌圈直徑，從平板背面測量最接近的整數(shù)毫米數(shù)并記錄。抑菌環(huán)的邊緣以肉眼見不到細菌明顯生長為限。

圖1 停乳鏈球菌的生長形態(tài)

圖2 停乳鏈球菌藥敏試驗

2 結(jié)果

2.1 細菌分離、鑒定

普通瓊脂平板上，37 ℃，36h培養(yǎng)后，未見到菌落；在綿羊鮮血瓊脂平板培養(yǎng)基上呈直徑0.1～1.0mm，灰白色，表面光滑，邊緣整齊的圓形和卵圓形呈鏈狀排列或成雙排列的小菌落，菌落周圍形成不透明的草綠色溶血環(huán)，呈α型溶血；在選擇性培養(yǎng)基BETA－SSA 瓊脂培養(yǎng)基上，呈乳白色菌落，菌落直徑為2～3mm，初步判定為疑似菌落。

2.2 CAMP試驗

35 ℃培養(yǎng)24h后，劃線交界處無箭頭樣的溶血區(qū)，為陰性。

2.3 生化試驗結(jié)果

按照《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》中鏈球菌屬生理生化指標為判定標準，進行生化試驗如表1所示，絕大部分菌株符合停乳鏈球菌生化反應(yīng)特性。

表1 生化鑒定結(jié)果

綜合細菌的形態(tài)特征、鮮血平板上溶血情況以及CAMP、生化鑒定試驗結(jié)果，最終從323 份乳樣中分離出216株停乳鏈球菌。

2.4 藥敏試驗結(jié)果

藥敏試驗結(jié)果表明：216株分離株對青霉素、四環(huán)素、紅霉素表現(xiàn)出明顯耐藥（見表2），耐藥率分別為71.30%、59.26%、52.78%，而對左氧氟沙星、萬古霉素、慶大霉素、甲砜霉素高度敏感，抑菌環(huán)明顯（見 圖2），敏 感 率 分 別 為76.39%、73.61%、65.74%、64.35%。（見圖3）。

表2 216株停乳鏈球菌耐藥性實驗結(jié)果

圖3 停乳鏈球菌對10種藥物的耐藥率

3 討論

3.1 分離手段多樣，羊品采集量大

停乳鏈球菌作為奶牛乳腺炎的致病菌之一，對奶牛養(yǎng)殖業(yè)危害很大，同時對人體健康也帶來了嚴重的威脅。本文通過對甘肅省蘭州市，河西地區(qū)金昌市、河東地區(qū)天水市的部分奶牛場患乳腺炎奶牛共抽取323份乳腺炎乳樣（包括臨床型和隱形乳腺炎）。采用6%～8%綿羊鮮血瓊脂平板培養(yǎng)基、選擇性培養(yǎng)（BETA－SSA 瓊脂培養(yǎng)基），普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，結(jié)合革蘭染色、鏡檢，對可疑菌落分離純化后進行生化試驗，最終從323 份乳樣中分離出216株停乳鏈球菌。

3.2 藥敏程度在實驗地表現(xiàn)各異

目前，由于抗生素的濫用使得細菌的耐藥性十分嚴重，本研究選用了抽樣奶牛場常用的10種抗菌藥物，將分離到的216株停乳鏈球菌進行了藥敏試驗，結(jié)果表明：分離株對青霉素、四環(huán)素、紅霉素表現(xiàn)出明顯耐藥，耐藥率分別為71.30%、59.26%、52.78%，其中對青霉素耐藥的有154株，對四環(huán)素耐藥的有128株，對紅霉素耐藥的有114株，說明上述三種抗菌藥物在臨床中被長期大量濫用，導致停乳鏈球菌已對上述三種抗菌藥高度耐藥，耐藥性非常嚴峻。

3.3 應(yīng)減少或停用大環(huán)內(nèi)酯類藥

提醒該地區(qū)牛場今后繼續(xù)用β－內(nèi)酰胺類抗生素，如：青霉素、頭孢曲松鈉；大環(huán)內(nèi)酯類，如紅霉素，或用四環(huán)素類抗生素來對抗停乳鏈球菌已沒有實際意義。而分離株對喹諾酮類藥物左氧氟沙星，多肽類抗生素萬古霉素、氨基糖苷類慶大霉素、以及酰胺醇類抗菌藥甲砜霉素表現(xiàn)出較高的敏感性，敏感率分別為76.39%、73.61%、65.74%、64.35%，敏感株有124株、165株、142株、139株。

3.4 建議

建議當?shù)啬膛鲈谥委熞酝Ｈ殒溓蚓鸀橹饕虏【娜橄傺准膊r應(yīng)優(yōu)先考慮用喹諾酮類、多肽類、氨基糖苷類抗菌藥物，同時建議當?shù)孬F醫(yī)臨床可交替使用抗菌藥或通過借助藥敏試驗制定聯(lián)合用藥方案，要科學、合理地使用抗菌藥物。

4 小結(jié)

本研究通過分離鑒定甘肅省部分地區(qū)乳腺炎乳樣中的停乳鏈球菌，以及通過藥敏試驗對分離株的耐藥現(xiàn)狀進行了分析，對養(yǎng)殖場戶及時掌握病情，同時對當?shù)孬F醫(yī)臨床正確、合理用藥提供了科學依據(jù)。

［1］ Denis M，Wedlock D N，Lacy－Hulbert S J，et al.Vaccines against bovine mastitis in the New Zealand context；what is the best way forward［J］.N Z Vet J，2009，57（3），132－140.

［2］ Taverna F，Negri A，Piccinini R，et al.Characterization of cellwall associated proteins of a Staphylococcus aureus isolated from bovine mastitis case by aproteomic approach［J］.Vet Microbiol，2007，119（2－4）：240－247.

［3］ 周利青，王文魁，奶牛乳房炎的研究進展［J］.畜牧獸醫(yī)科技信息，2005（5）：8－9.

［4］ 朱戰(zhàn)波，王紅，劉宇，等.奶牛乳房炎鏈球菌分離株的鑒定及藥敏試驗［J］.現(xiàn)代畜牧獸醫(yī)，2007（12）：8－10.

［5］ 白龍，郝永清，范利霞，等.奶牛乳腺炎無乳鏈球菌的分離鑒定［J］.畜牧與飼料科學2010，31（1）：96－97.

［6］ 李新圃，張禮華，李宏勝，等.奶牛乳房炎主要致病菌的藥敏試驗［J］.中國獸醫(yī)科技，1995，25（9）：27－28.

［7］ 劉春杰，楊麗華，張春，等.長春地區(qū)奶牛乳腺炎主要致病菌分離鑒定及藥敏試驗［J］.南方農(nóng)業(yè)，2014，8（18）：155－156.

［8］ 馬保臣，李建基，劉錫武.奶牛急性乳腺炎病原菌的分離與鑒定研究［J］.黑龍江畜牧獸醫(yī)，2003（1）：35－36.

［9］ 陸承平，獸醫(yī)微生物學［M］.北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2007.

［10］ Khan A，Dass C，Ramamurthy T，et al.Antibiotic resistance，virulence gene，and molecular profiles of Shiga toxin producing Escherichia coli isolates from diverse sources in calcutta［J］.JClin Microbiol，2002，40（6），2009－2015.

［11］ 王禮偉，楊亞東，屈勇剛，等，新疆石河子地區(qū)奶牛乳房炎鏈球菌的分離鑒定及藥敏試驗［J］.動物醫(yī)學進展，2014，35（2）：124－127.

［12］ 東秀珠，蔡妙英.常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊［M］.北京：科學出版社.2001：248－249.

［13］ Erskine R J，Walker R D，Bolin C A，et al.Trends in Antibacterial Susceptibility of Mastitis Pathogens During a Seven－Year Period［J］.Dairy Sci，2002，85：1111－1118.