向柄彥，郭 元

（1.貴州省遵義市第一人民醫(yī)院骨科 563000；2.河北省玉田縣醫(yī)院骨科 064100）

隨著骨科手術(shù)技術(shù)的發(fā)展及抗菌藥物的不斷更新?lián)Q代，骨髓炎的治療取得了不斷進(jìn)步，但慢性感染性骨缺損是骨科醫(yī)師致力解決的難題。目前，局部應(yīng)用聚甲基丙烯酸甲酯慶大霉素珠鏈不能降解，需二次手術(shù)取出，并能為病原菌的生長提供適宜的生長環(huán)境，造成感染復(fù)發(fā)[1-3]。隨著生物組織工程的不斷發(fā)展，研究發(fā)現(xiàn)人工合成的羥基磷灰石（hydroxyapatite，HP）與殼聚糖（chitosan，CS）的理化性質(zhì)、結(jié)構(gòu)與人體本身的性狀基本相同，且無毒副作用。本研究在治療慢性骨髓炎的前期實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，擬構(gòu)建納米羥基磷灰石復(fù)合膠原／殼聚糖（nanohydroxyapatite／chitosan glucomannan scaffold，n-HA／CS）復(fù)合萬古霉素脂質(zhì)體載藥微球并聯(lián)合BMP-2，構(gòu)建新型治療感染性骨缺損的新型載藥緩釋系統(tǒng)，最后聯(lián)合BMP-2植入兔慢性骨髓炎模型體內(nèi)，從組織工程學(xué)角度探討其修復(fù)慢性感染性骨缺損的可行性，欲為今后臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料 健康新西蘭大白兔60只[許可證號：SCXK（渝）2012-0005]，5～6月齡，雌雄不限，體質(zhì)量（2.5±0.2）kg，第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供。納米羥基磷灰石、殼聚糖（山東濰坊市海之源生物公司，中國）；萬古霉素（華北制藥有限公司，中國）；冷凍干燥機(jī)（Thermo公司，美國）；切片機(jī)（Leica公司，德國）。金黃色葡萄球菌ATCC29210由遵義市第一人民醫(yī)院檢驗(yàn)科惠贈。BMP-2／PLA和萬古霉素／PLA緩釋微球由前期實(shí)驗(yàn)制作。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)菌培養(yǎng) 在無菌操作臺上，將金黃色葡萄球菌接種于金黃色葡萄球菌固體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)。挑取單個菌落接種于MH液體培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)過夜，并于530 nm處測定菌液的吸光度值，計(jì)算菌液濃度。將測定的菌液用液體培養(yǎng)基稀釋至1×108cfu／mL，4℃保存。

1.2.2 載藥組織支架材料的制備 根據(jù)Ma等[4]等方法將殼聚糖溶液、納米羥基磷灰石適當(dāng)比例混合，倒入準(zhǔn)備好的鑄模槽，通過凍干技術(shù)與化學(xué)交聯(lián)方法制備成固體材料，并進(jìn)入含有BMP-2／PLA和萬古霉素／PLA緩釋微球溶液中，-80℃冷凍2h后放入真空冷凍干燥機(jī)內(nèi)干燥12h，用鈷-60（60CO）輻照消毒備用。采用掃描電子顯微鏡檢測觀察空隙形狀，用萬能材料試驗(yàn)機(jī)檢測支架材料的抗壓能力，觀察是否符合實(shí)驗(yàn)要求。將制備成功的固體材料置于4℃冰箱保存。

1.2.3 慢性骨髓炎模型的構(gòu)建 將新西蘭大白兔稱重后，予以1%戊巴比妥經(jīng)耳緣靜脈麻醉，剪除左脛骨上端毛發(fā)，固定于操作臺上，常規(guī)消毒鋪巾后，于左側(cè)脛骨近端切口，逐層分離至骨膜，3mm克氏針鉆孔至髓腔，依次注入5%甘油酸鈉0.1 mL，1×108cfu／mL金黃色葡萄球菌液0.1mL骨蠟封閉缺口。無菌生理鹽水沖洗傷口，逐層縫合。術(shù)后不應(yīng)用抗菌藥物，肢體不制動，單獨(dú)飼養(yǎng)，標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)食，4周后行大體觀察及左下肢X線片檢查以確定造模是否成功。

1.2.4 實(shí)驗(yàn)分組及方法 建模成功后分為4組，A組：空白對照組不做任何處理；B組：單純n-HA／CS支架材料；C組：n-HA／CS載萬古霉素脂質(zhì)體種植體；D組：n-HA／CS載萬古霉素脂質(zhì)體與BMP-2種植體。8周后行左脛骨X線片并進(jìn)行脛骨病理學(xué)檢測。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，所有數(shù)據(jù)均采用±s表示，組間差異顯著性檢驗(yàn)采用單因素方差分析（One-Way ANOVA），以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 支架材料的電子顯微鏡掃描及生物力學(xué)測試 支架材料經(jīng)電子顯微鏡掃描后呈現(xiàn)出豐富的不規(guī)則多孔結(jié)構(gòu)，各孔之間相通性好，孔徑大小為80～270μm，平均孔徑為146.53μm；彈性模量為27.50MPa，壓縮強(qiáng)度為（0.75±0.04）MPa，見圖1、2。

2.2 慢性骨髓炎動物模型的鑒定 造模4周后，左側(cè)脛骨近端皮膚紅腫并伴膿腫及竇道形成。X線片提示不同程度的低密度影，新骨形成及骨膜反應(yīng)，見圖3、4。

2.3 治療8周后X線檢測 治療8周后，A組和B組脛骨近端仍見低密度影，骨膜反應(yīng)；C組和D組可見新骨形成，未見明顯的骨膜反應(yīng)，說明植入本實(shí)驗(yàn)制作的植入材料后對慢性骨髓炎有較好的效果，見圖5。

2.4 各治療組Norden評分分析 治療8周拍X線片后進(jìn)行Norden評分并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，D組Norden評分明顯小于其余3組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；C組明顯小于A、B組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；A組與B組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

圖1 支架材料電子顯微鏡掃描

圖2 支架材料生物力學(xué)測試

圖3 大體觀察

圖4 造模4周后X線檢測

2.5 各組骨組織HE染色 治療8周后，提取骨組織進(jìn)行HE染色，見A組和B組骨組織有明顯的中性粒細(xì)胞浸潤，骨小梁紊亂、破壞；C組及D組未見明顯的炎性細(xì)胞浸潤，骨小梁較為整齊；D組骨小梁較C組粗大。見圖6。

圖5 治療8周后各組X線檢測

表1 各組Norden評分結(jié)果（±s，分）

表1 各組Norden評分結(jié)果（±s，分）

15 2.64±0.33 B組 15 2.63±0.36 C組 15 1.14±0.29 D組評分A組組別 n Norden 15 0.89±0.42

圖6 骨組織HE染色（×100）

3 討論

慢性骨髓炎的治療是骨科疾病的難題。近年來，隨著抗菌藥物的不斷升級及骨科診療技術(shù)的不斷進(jìn)步，臨床對骨髓炎的治療不斷進(jìn)步，但治療效果仍不滿意。目前，慢性骨髓炎的治療主要包括徹底清創(chuàng)、持續(xù)沖洗及抗菌藥物的應(yīng)用[5]。長期應(yīng)用抗菌藥物存在多種不良反應(yīng)，如胃腸道反應(yīng)、耳毒性、腎毒性及骨髓抑制等。研究表明局部應(yīng)用抗菌藥物可達(dá)到有效的濃度并可減輕不良反應(yīng)。最早應(yīng)用于臨床的載藥植入材料是一種聚甲基丙烯酸甲酯，其在植入體內(nèi)后會放熱，單體成分對人體具有毒性，組織相容性差，需二次手術(shù)取出，患者創(chuàng)傷及經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)重，限制了其臨床應(yīng)用[6]。所以，研發(fā)新的局部抗菌藥物緩釋系統(tǒng)為慢性骨髓炎的治療提供了新的治療方案。

本實(shí)驗(yàn)通過制作符合生物力學(xué)要求的生物工程支架材料，并負(fù)載萬古霉素和BMP-2，使其在體內(nèi)緩慢釋放，達(dá)到有效的局部濃度，為慢性骨髓炎的治療和骨愈合提供良好的環(huán)境。

隨著生物工程及骨組織工程的不斷發(fā)展，研究發(fā)現(xiàn)CS及n-HA均是天然材料，有良好的生物活性和理化特性，作為人體組織工程材料的應(yīng)用研究已取得了一定的成果[7]。但在CS和n-HA分別單獨(dú)應(yīng)用的研究中還是暴露出一定缺陷，比如機(jī)械性能弱、抗壓能力弱及體內(nèi)不易吸收等問題[8]。n-HA作為載藥體具有多方面的優(yōu)勢：（1）無毒、生物相容性好、無刺激及免疫原性，對生物組織無損傷。（2）獨(dú)特的多孔結(jié)構(gòu)，巨大的比表面積及高表面活性，能黏附和傳遞大分子藥物，并可以通過改變孔徑及孔隙率來達(dá)到藥物的穩(wěn)定緩慢釋放。（3）化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，與許多藥物無化學(xué)反應(yīng)，可以做為多種藥物的緩釋載體。研究發(fā)現(xiàn)CS通過溶解后可釋放氨基（NH2＋），這些氨基通過結(jié)合負(fù)電子來抑制細(xì)菌的生長。這種生物特性是CS在治療慢性骨感染方面顯示出了獨(dú)特的優(yōu)勢。CS及n-HA的聯(lián)合應(yīng)用使其各自互補(bǔ)，以改善各自的缺陷。

BMP-2是經(jīng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)的最重要的骨誘導(dǎo)因子，是控制骨缺損修復(fù)的信號通路的必需成分，是目前骨組織工程研究最多和應(yīng)用最廣泛的生長因子[9]。

聚乳酸具有良好的生物相容性及可降解性，最終代謝產(chǎn)物為水（H2O）和二氧化碳（CO2），是美國食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）批準(zhǔn)應(yīng)用的醫(yī)療高分子可降解材料[10]。目前，應(yīng)用聚乳酸作為緩釋載體制備化療藥物、激素、胰島素、抗菌素等緩釋藥物取得良好的療效，部分已應(yīng)用于臨床[11-12]。鑒于上述優(yōu)點(diǎn)，本課題選用聚乳酸作為BMP-2和萬古霉素的緩釋載體。

通過構(gòu)建慢性骨髓炎模型并植入不同的植入材料，經(jīng)過8周后，行X線片A組和B組脛骨近端仍見低密度影，骨膜反應(yīng)；C組和D組可見新骨形成，未見明顯的骨膜反應(yīng)；行Norden評分并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，D組Norden評分明顯小于其余3組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；C組明顯小于A、B組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；A組與B組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。并進(jìn)行各組骨組織的HE染色，A組和B組骨組織有明顯的中性粒細(xì)胞浸潤，骨小梁紊亂、破壞；C組及D組未見明顯的炎性細(xì)胞浸潤，骨小梁較為整齊；D組骨小梁較C組粗大。

[1] Huang HK，Chiang CC，Su YP，et al.Rote of autologous bone graft in the surgical treatment of atrophic nonunion midshaft clavicular fractures[J].Orthopedics，2012，35（2）：e197-201.

[2] Sharifi D，Khoushkerdar HR，Abedi G，et al.Mechanical propeties of radial bone defects treated with autogenous graft covered with hydroxyapatite in rabbit[J].Acta Cir Bras，2012，27（3）：256-259.

[3] Ateschrang A，Ochs BG，Ludemann M，et al.Fibula and tibifusion with cancellous allograft vitalised with autologous bone marrow；first result for infected tibial non-union[J].Arch Orthc Trauma Surg，2009，129（1）：97-104.

[4] Ma T，Shang BC，Tang H，et al.Nano-hydroxyapatite／chitosan／kojac glucomannan scaffolds loaded with cationic liposomal vancomycin：preparation，in vitro release and activity against Staphylococcus aureus biofilms[J].J Biomater Sci Polym Ed，2011，22（12）：1669-1681.

[5] Hatzenbuehler J，Pulling TJ.Diagnosis and management of osteomyelitis[J].Am Fam Physician，2011，84（9）：1027-1033.

[6] Shinto Y，Uchida A，Korkusuz F，et al.Calcium hydroxyapatite ceramic used as a delivery system for antibiotics[J].J Bone Jt Surg Br，1992，74（4）：600-607.

[7] 趙欣，王德平.納米羥基磷灰石作為藥物載體材料的研究進(jìn)展[J].材料導(dǎo)報(bào)，2010，24（12）：116-120.

[8] Lahiji A，Sohrabi A，Hungerford DS，et al.Chitosan supports the expression of extracellular mat rix proteins in human osteoblasts and chondrocytes[J].Biomed Mater Res，2000，51（4）：586-595.

[9] Rey-Rico A，Silva M，Couceiro J，et al.Osteogenic efficiency of in situ gelling poloxamine systems with and without bone morphogenetic protein-2[J].Eur Cell Mater，2011，21：317-340.

[10] Anusha A，Menon D，Nair S，et al.A molecular receptor targeted，hydroxyapatite nanocrystal based multimodal contrast agent[J].Biomaterials，2013，31（9）：2606-2616.

[11] 樊國棟，張春梅.聚乳酸在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用研究進(jìn)展[J].科技導(dǎo)報(bào)，2010，31（19）：103-107.

[12] 許鋒，詹玉林，宋興華.骨形態(tài)發(fā)生蛋白2基因治療骨缺損研究進(jìn)展[J].醫(yī)學(xué)綜述，2012，32（11）：1612-1614.