徐吉　孟德強　劉德昌

(復(fù)旦大學(xué)附屬金山醫(yī)院骨科，上?！?01508)

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·論著·

克林霉素幾丁糖緩釋微球的制備及其體外緩釋作用的研究

徐吉孟德強劉德昌

(復(fù)旦大學(xué)附屬金山醫(yī)院骨科，上海201508)

摘要目的：制備克林霉素幾丁糖緩釋微球，測定其載藥量和包封率，考察其體外緩釋作用和抑菌作用。方法： 采用乳化化學(xué)交聯(lián)法制備克林霉素幾丁糖緩釋微球，應(yīng)用透射電子掃描顯微鏡和激光衍射式粒度分布測量儀觀察微球的形態(tài)和粒徑，采用紫外分光光度法測定克林霉素幾丁糖緩釋微球的載藥量和包封率。建立體外釋放體系，研究微球的體外藥物緩釋作用和體外抑菌作用。通過繪制抑菌環(huán)時間面積曲線觀察微球的體外抑菌作用。結(jié)果：克林霉素幾丁糖緩釋微球的大小均勻，分散性較好，平均粒徑為(153.2±13.7)μm，載藥量為(39.8±1.6)%，包封率為(79.6±3.5)%。在PH7.4的磷酸鹽緩沖液中，克林霉素幾丁糖緩釋微球的累計釋放率第1小時為16.5%，第2小時為21.6%，第3小時為33.2%，第24小時達53.7%；克林霉素對照品第3小時的累計釋放率已達99.6%。載藥微球的抑菌面積時間曲線表明，釋藥3 d后載藥微球仍具有明顯的抑菌作用。結(jié)論：克林霉素幾丁糖緩釋微球具有良好的藥物包封率，故體外緩釋作用和體外抑菌作用較好。

關(guān)鍵詞克林霉素；幾丁糖；微球；緩釋作用；抗菌作用

高能量創(chuàng)傷所致骨折的骨粉碎程度高，軟組織破壞范圍廣，骨折繼發(fā)感染率可達23%[1]。伴有細菌感染的骨折患者，如治療不當(dāng)，可導(dǎo)致感染性骨不連、慢性骨髓炎、關(guān)節(jié)僵硬等[2]。有研究[3]表明，病灶局部增加抗生素濃度可以有效控制組織細菌感染，但療程長、操作繁瑣，其臨床應(yīng)用受限。醫(yī)用幾丁糖是一種天然聚陽離子生物多糖，具有優(yōu)良的生物相容性和生物降解性，是理想的細胞外基質(zhì)材料。本研究以幾丁聚糖為載體、克林霉素為負載藥物，探索一種新型局部抗生素緩釋系統(tǒng)，并觀察其體外緩釋作用和抑菌性能，以期為克林霉素幾丁糖局部緩釋系統(tǒng)的臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

1資料與方法

1.1材料鹽酸克林霉素(浙江天臺藥業(yè)有限公司)；幾丁糖(上海其勝生物制劑有限公司)；25%戊二醛(國藥集團化學(xué)試劑有限公司)；吐溫80(國藥集團化學(xué)試劑有限公司)；液體石蠟(廣州白云山醫(yī)藥集團股份有限公司)；石油醚(國藥集團化學(xué)試劑有限公司)；丙酮(國藥集團化學(xué)試劑有限公司)。

1.2儀器分析天平(德國KERN公司，型號：120-4M)；紫外可見分光光度計(美國HACH公司)；透射電子顯微鏡(日本日立公司，型號：JEM-200CX)；激光衍射式粒度分布測量儀(日本島津公司，型號：SALD-201V)。

1.3克林霉素幾丁糖緩釋微球的制備采用乳化化學(xué)交聯(lián)法制備克林霉素幾丁糖緩釋微球，取400 mg鹽酸克林霉素，將其溶于20 mL 0.9%氯化鈉水溶液中，加入1 g醫(yī)用幾丁糖，制成水相。取10.0 g吐溫80，加入80 mL液體石蠟，置于反應(yīng)瓶中加熱攪拌，制成油相。將水相緩慢滴入油相，使之形成穩(wěn)定的乳化體系，緩慢加入25%的戊二醛2 mL，40℃交聯(lián)固化2 h。依次用石油醚、無水丙酮洗滌脫水，然后置于真空干燥器中干燥，制備得到載藥微球。以同樣的方法制備空載微球。電鏡觀察微球表面形貌、粒徑大小、分布。

1.4微球的粒徑及形態(tài)在光學(xué)顯微鏡下觀察微球的球形及分散性，在透射電子掃描顯微鏡下觀察分析微球的形狀、粒徑大小和分布。

1.5微球的粒徑測定取一定量克林霉素幾丁糖緩釋微球，用超純水稀釋3~5倍，用激光衍射式粒度分布測量儀測定其粒徑大小。

1.6微球載藥量及包封率的測定

1.6.1紫外分光光度法鹽酸克林霉素分子結(jié)構(gòu)中含甲硫基團，有機硫化物很易被完全氧化，生成亞砜(R2SO)，并進一步形成砜(R2SO2)[4]。在酸性條件下用碘酸鉀氧化鹽酸克林霉素中的硫原子，釋放出游離碘，定量萃取至環(huán)己烷中，用分光光度法于520 nm波長處測定游離碘的含量。

1.6.2標(biāo)準曲線的繪制與包封率的測定精確稱取鹽酸克林霉素對照品100 mg，置于50 mL容量瓶中，加水配制成2 mg/mL的標(biāo)準液。精確量取1、2、3、4、5 mL標(biāo)準液，分別置入5個25 mL容量瓶中，均加入1%(g/mL)碘酸鉀溶液4mL、30%硫酸溶液3 mL、環(huán)己烷10 mL，置于60℃水浴中加熱45 min。冷卻后，將環(huán)己烷層傾入25 mL量瓶中。用環(huán)己烷反復(fù)萃取3次，合并萃取液，加環(huán)己烷稀釋、混勻，于520 nm波長處測定吸光度。將吸光度和對應(yīng)濃度進行線性回歸分析。結(jié)果表明，鹽酸克林霉素為0.1~0.5 mg/mL時，吸光度與其濃度呈良好的線性關(guān)系，回歸方程為C=l.062A+0.0038，相關(guān)系數(shù)R2=0.9996[A表示吸光度，C表示濃度(mg/mL)]。

精確稱取克林霉素幾丁糖緩釋微球50 mg，按上述步驟于520 nm波長處測定吸光度，用回歸方程求出濃度，按以下公式計算藥物載藥量和包封率。包封率(%)=微球中克林霉素的含量/克林霉素的總量×100%；克林霉素的載藥量(摩爾比%)=微球中克林霉素的含量/載藥微球的總量×100%。

1.7體外釋放試驗精確稱取克林霉素幾丁糖緩釋微球50 mg及克林霉素50 mg，分別置于透析袋；密封置于250 mL、PH7.4的磷酸鹽緩沖液，放入36℃的恒溫箱中，以 100 r/min 的速率震蕩；分別于24、48、72、120、168、240 h時收集釋放液，同時加入相同溫度、相同體積的磷酸鹽緩沖液；用紫外分光光度儀測定釋放液的吸光度，分別計算出緩釋微球在不同時間點的的釋放液濃度、釋放量和累計釋放率。

1.8體外抑菌試驗將釋放不同時間的克林霉素幾丁糖緩釋微球置于接種有金黃色葡萄球菌的固體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)12 h，用空白微球作對照。測定不同釋放時間后抑菌環(huán)的直徑和面積，繪制抑菌環(huán)時間面積曲線。

2結(jié)果

2.1微球的基本特性克林霉素幾丁糖緩釋微球的平均粒徑為(153.2±13.7)μm，載藥量為(39.8±1.6)%，包封率為(79.6±3.5)%。光學(xué)顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，微球顆粒均勻，分散性良好，無粘連，圓整度較好。透射電鏡下觀察微球，如圖1~2所示，空載微球和克林霉素幾丁糖緩釋微球均呈球形，粒子形態(tài)規(guī)整，分布均勻；說明本研究制備的微球大小均勻，分散性較好，微球表面存在少許褶皺。

圖1　空載微球的透射電鏡圖

圖2　載藥微球的透射電鏡圖

2.2克林霉素幾丁糖緩釋微球的體外釋放分析克林霉素幾丁糖緩釋微球和克林霉素在PH7.4的磷酸鹽生理緩沖液中的24 h內(nèi)累計釋放率的比較見圖3?？肆置顾貛锥√蔷忈屛⑶虻?小時累計釋放率為16.5%,第2小時為21.6%,第3小時為33.2%,第24小時為53.7%；而克林霉素第1小時累計釋放率為87.6%,第2小時為96.2%，第3小時達99.6%。圖4為克林霉素幾丁糖緩釋微球在10 d內(nèi)的累計釋放率曲線，呈逐天增長趨勢，第1天釋放率為53.7%，至第10天釋放率達91.3%。由此可見，微球具有良好的緩釋效果。

圖3　克林霉素幾丁糖緩釋微球和克林霉素24 h內(nèi)的累計釋放率比較

2.3克林霉素幾丁糖緩釋微球的體外抑菌實驗空白微球無抑菌作用，抑菌環(huán)直徑為0。不同時間點載藥微球的抑菌環(huán)的直徑和面積見表1。釋藥初期抑菌效果最強，抑菌環(huán)面積為(5.76±0.22 )cm2，釋藥1 d后抑菌環(huán)面積為(2.63±0.23) cm2，至釋藥4 d后抑菌環(huán)面積降至(0.07±0.02) cm2。載藥微球的抑菌環(huán)時間面積曲線表明，隨著釋放時間的延長，克林霉素幾丁糖緩釋微球的抑菌環(huán)面積變小，釋藥后1~2 d后微球的抑菌作用下降較迅速，但釋藥3 d后載藥微球仍具有明顯的抑菌作用。見圖5。

圖4　克林霉素幾丁糖緩釋微球10 d內(nèi)的

項目釋放時間/d012345710直徑/cm2.61±0.061.72±0.090.86±0.110.43±0.050.28±0.030.19±0.020.11±0.030.06±0.01面積/cm25.76±0.222.63±0.230.67±0.130.18±0.080.07±0.020.03±0.010.02±0.010.01±0.01

圖5　克林霉素幾丁糖微球抑菌環(huán)的時間面積曲線

3討論

在現(xiàn)代社會，車禍、高處墜落傷等高能量損傷的發(fā)生率日益增加，開放性創(chuàng)傷的救治顯得十分重要。開放性骨折常伴有細菌感染，如果不能及時有效地控制感染，易導(dǎo)致骨不連或慢性骨髓炎，治療難度加大。如何在控制感染的情況下促進骨愈合，成為骨科研究領(lǐng)域的重要課題。

Nickel等[3]的研究表明，要殺滅潛伏在生物膜內(nèi)的細菌，局部抗生素濃度必須高于致病菌最低抑菌濃度的許多倍。然而，全身應(yīng)用抗生素常難以達到這樣的治療要求；且對于肝腎功能減退的患者，不宜應(yīng)用大劑量抗生素。若能在局部較長時間地維持高濃度的抗生素釋放，則可更有效地控制組織中的細菌感染狀況。局部應(yīng)用抗生素的方法主要有局部直接注射法[5]、閉合灌注和吸引法[6]等。局部給藥雖有利于增加病灶的抗生素濃度，但因療程長、操作繁瑣使其臨床應(yīng)用受限。

Buchholz等[7]首次報告應(yīng)用復(fù)合抗生素骨水泥預(yù)防和治療人工全髖關(guān)節(jié)置換術(shù)后感染，自此，抗生素骨水泥在臨床的應(yīng)用已超過了40年。美國食品與藥物管理局(FDA)已經(jīng)批準了將低劑量的抗生素骨水泥用于感染性人工關(guān)節(jié)術(shù)后的翻修術(shù)?？股毓撬嗟娜秉c是：骨水泥在聚合時的高溫對抗生素的選擇有影響；骨水泥不能在體內(nèi)降解，需二次取出[8]；有效抗菌濃度維持時間不夠。

近年來，為了克服抗生素骨水泥的再次感染和二次取出的缺點，關(guān)于可降解材料結(jié)合抗生素的研究逐漸增多。醫(yī)用幾丁糖是由2-氨基-2-脫氧-β-D-葡萄糖通過β-1,4 糖苷鍵聚合的一種天然聚陽離子生物多糖[9]，因其具有良好的組織相容性、在體內(nèi)最終降解為寡聚糖和單糖且無不良反應(yīng)，故幾丁(聚)糖及其衍生物被廣泛地應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域[10-12]。幾丁聚糖可以通過化學(xué)交聯(lián)、靜電吸附等作用包裹藥物，在藥物表面形成半透膜，從而顯著延長藥物釋放時間，達到緩釋的目的[13]。例如，以幾丁聚糖為載體，將抗癌藥物順鉑制成微球后進行栓塞治療，藥物可在靶部位濃集并緩慢釋放，從而減少了全身不良反應(yīng)，增強了抗癌效果。陳愛明等[14]制備了幾丁糖慶大霉素緩釋棒，結(jié)果證實作用良好。

國內(nèi)外已有局部長期小劑量釋放抗生素的研究[15]，但尚無關(guān)于克林霉素釋放系統(tǒng)的相關(guān)報告。開放性骨折感染及慢性骨髓炎的病原體以金黃色葡萄球菌常見。克林霉素用于骨髓炎及皮膚軟組織創(chuàng)傷或術(shù)后感染的效果較好，而且其抗菌譜廣，對需氧革蘭陽性球菌[金黃色葡萄球菌和表皮葡萄球狀菌、鏈球菌(糞腸道球菌除外)、肺炎球菌]、厭氧革蘭陰性桿菌屬、厭氧革蘭陽性不產(chǎn)芽孢桿菌屬、厭氧和微需氧的革蘭陽性桿菌屬均有殺傷力。然而，全身應(yīng)用時對肝腎功能的影響及用藥后偽膜性腸炎的高發(fā)生率限制了克林霉素的臨床應(yīng)用，特別對于高齡、肝腎功能不全的患者。因此，本研究選擇克林霉素作為負載藥物，制備克林霉素幾丁糖局部釋放系統(tǒng)，以利于其在骨與軟組織感染中的應(yīng)用。

本研究結(jié)果顯示，以幾丁糖作為藥物載體、戊二醛為交聯(lián)劑、吐溫80為乳化劑，采用乳化交聯(lián)法制備的克林霉素幾丁糖緩釋微球的圓整度、分散性良好，平均粒徑為(153.2±13.7)μm，載藥量為(39.8±1.6)%，包封率為(79.6±3.5)%。掃描電鏡下觀察發(fā)現(xiàn)載藥微球表面有褶皺，推測是由于溫度及濕度的變化引起的[16]?？肆置顾貛锥√蔷忈屛⑶蚝涂肆置顾貙φ掌返乃幬镝尫徘€顯示，克林霉素對照品在第2小時的累計釋放率已達96.2%，而克林霉素幾丁糖緩釋微球第2小時的累計釋放率僅為21.6%，至第10天釋放率方達91.3%。由此可見，藥物緩釋微球具有良好的緩釋效果。微球內(nèi)部的藥物由于空間的阻礙以及載體的吸附包裹作用而使其釋放速率顯著低于單純藥物粉末[17]?？肆置顾貛锥√蔷忈屛⑶虻捏w外抑菌實驗表明，釋藥3 d后，載藥微球仍具有明顯的抑菌作用，顯示出良好的抑菌活性。

綜上所述，本研究首次制備的克林霉素幾丁糖緩釋系統(tǒng)具有良好的體外緩釋作用和體外抑菌活性，通過進一步研究其用于治療骨感染的療效，有望將其應(yīng)用于臨床。

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Preparation of Clindamycin Loaded Chitosan Sustained-Release Microspheres and Drug Release Study in Vitro

XUJiMENGDeqiangLIUDechang

DepartmentofOrthopedics,JinshanHospital,FudanUniversity,Shanghai201508，China

AbstractObjective：To prepare clindamycin loaded chitosan sustained-release microspheres, determine drug loading and drug encapsulation efficiency of the microspheres, and observe the effect of sustained-release and bacteriostasis in vitro. Methods:The microspheres were prepared by emulsified chemical cross-linking method. The morphology and particle size of microspheres were observed by transmission electron microscopy and laser diffraction particle size analyzer. The drug loading and drug encapsulation efficiency of clindamycin loaded chitosan sustained-release microspheres were tested by UV spectrophotometry method. The effect of drug sustained-release and bacteriostasis in vitro was studied by establishing release system in vitro. The bacteriostasis of microspheres in vitro was observed by plotting the area-time curve of inhibition ring. Results: The size of clindamycin loaded chitosan sustained-release microspheres was uniform, while the dispersion was good. The average particle size of the microspheres was (153.2±13.7)μm. The average drug loading was(39.8±1.6)%. The mean encapsulation efficiency was (79.6±3.5)%. The cumulative release percentage of clindamycin loaded chitosan sustained-release microspheres in pH 7.4 phosphate buffer saline(PBS) was 16.5% at the first hour, 21.6% at the second hour, 33.2% at the third hour and 53.7% at the twenty-fourth hour. The cumulative release percentage of clindamycin control was 99.6% at the third hour. The microspheres still had obvious bacteriostasis after 3 days’ release, as the bacteriostasis time area curve of the drug loaded microsphere showed. Conclusions: The encapsulation efficiency of clindamycin loaded chitosan sustained-release microspheres was good, so that the sustained-release effect and bacteriostsis in vitro was also good.

Key WordsClindamycin;Chitosan;Microspheres;Sustained-release effect;Bacteriostasis

中圖分類號R681.2

文獻標(biāo)識碼A

基本項目： 上海市金山區(qū)科學(xué)技術(shù)委員會資助項目(編號：2011-3-02)