向地英　薛木易　鄒麗紅

摘要：以鐵炮百合無菌苗的葉片、鱗片為外植體，進行鐵炮百合再生體系的研究。結果表明：鱗片的誘導分化能力高于葉片，鱗片分化培養(yǎng)基（MS+0.5 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA、MS+1.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA）的分化率高達90.98%。用葉片為外植體，不同部位對不定芽的誘導影響較大，以葉片中部分化能力最強，上部次之，下部最差。葉片分化培養(yǎng)基為MS+1.0 mg/L BA+0.2 mg/L NAA，分化率為85.36%。2，4-D濃度對愈傷組織的誘導影響顯著，愈傷誘導培養(yǎng)基以MS+0.5 mg/L 6-BA+0.2 mg/L 2，4-D為佳，愈傷率達80%以上。

關鍵詞：鐵炮百合；離體再生；鱗片

中圖分類號： S682.2+65.04+3；Q943.1文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2015）02-0055-03

收稿日期：2014-10-13

基金項目：河北省保定市科技項目（編號：12ZF073）。

作者簡介：向地英（1978—），女，重慶云陽人，博士，講師，主要從事觀賞植物抗逆生理研究。E-mail：43823526@qq.com。鐵炮百合（Lilium longifllorum）原產于我國臺灣，是重要的切花材料，其花朵極香，含有芳香油，可作香料，具有極高的觀賞價值、經濟價值[1-2]。傳統(tǒng)雜交育種技術因周期長，短期內無法培育出新的品種以滿足需求。植物的轉基因育種技術通過抑制內源基因或導入外源基因而定向改造植物性狀，突破了物種間的界限，創(chuàng)造出新種質，大大縮短育種進程。高效離體再生是轉基因的基礎環(huán)節(jié)。近年來，很多學者選用珠芽、幼莖段、葉片、鱗片等不同外植體嘗試百合的組織培養(yǎng)[3-5]。關于鐵炮百合的高效再生報道較少。本試驗以鐵炮百合組培苗葉片為材料，對不同外植體、不同激素配比進行研究，選出誘導愈傷、分化不定芽能力高的培養(yǎng)基類型，建立鐵炮百合高效離體再生體系，旨在為鐵炮百合遺傳轉化體系的建立奠定基礎。

1材料與方法

1.1材料

試驗材料為鐵炮百合無菌苗。

1.2方法

1.2.1不定芽的增殖取長3～5 cm的不定芽接種于繼代培養(yǎng)基MS+0.7 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA中，附加蔗糖3%、瓊脂0.6%，pH值為5.8。培養(yǎng)條件為溫度（25±1） ℃，光照周期12 h/d，光照度2 000 lx（約1個月繼代1次）。

1.2.2再生苗小鱗片、葉片誘導分化培養(yǎng)基的預篩選取再生小植株小鱗莖上的外層鱗片及葉片，接種在不同濃度激素組合的分化培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基為MS+6-BA（0、0.5、1.0） mg/L+NAA 0.5 mg/L+蔗糖30 g/L+瓊脂6 g/L、MS+6-BA（05、1.0） mg/L+NAA 0.2 mg/L+蔗糖30 g/L+瓊脂 6 g/L、MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 1.0 mg/L+蔗糖30 g/L+瓊脂6 g/L。培養(yǎng)條件為溫度（25±1） ℃，光照周期 12 h/d，光照度2 000 lx，30 d后統(tǒng)計愈傷分化情況。

1.2.3葉片不同部位的誘導能力切取葉片上、中、下3段，在相同培養(yǎng)基類型及相同環(huán)境條件下培養(yǎng)，培養(yǎng)基類型為MS+1.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA、MS+0.5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA，黑暗條件下培養(yǎng)，定期觀察其生長情況。

1.2.4再生苗鱗片的分化能力將再生植株苗上的小鱗片放在MS+（0.5、1.0、2、5、10） mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA+蔗糖30 g/L+瓊脂6 g/L培養(yǎng)基內培養(yǎng)。培養(yǎng)條件為溫度 （25±1） ℃，光照周期12 h/d，光照度2 000 lx，定期觀察其生長情況。

1.2.5不同濃度2，4-D對葉片基部誘導分化能力的影響切取葉片的基部接種于MS+0.5 mg/L 6-BA+（0.2、3.0） mg/L 2，4-D、MS+（0、1.0） mg/L 6-BA+0.2 mg/L 2，4-D、MS+3.0 mg/L 2，4-D培養(yǎng)基內暗培養(yǎng)，定期觀察其生長情況。

2結果與分析

2.1鱗片、葉片誘導分化培養(yǎng)基預篩選

以分化率、誘導率、生長勢為指標篩選出適宜的培養(yǎng)基，比較鱗片與葉片的誘導分化能力。鱗片的誘導分化能力明顯高于葉片。鱗片以MS+1.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA、MS+0.5 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA培養(yǎng)基為佳，葉片以MS+1.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA、 MS+0.5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA培養(yǎng)基為佳。

2.2葉片不同部位誘導分化能力比較

葉片在培養(yǎng)基上培養(yǎng)一段時間后，葉片邊緣出現少量愈傷組織，20 d后愈傷組織表面出現白色芽點，再經過一段時間，芽點處形成大小、長短不一的不定芽，不定芽均為白色（圖1）。葉片不同部位分化能力不同，葉片中部分化率最高，上部次之，下部分化率最低（表1）。MS+1.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA比MS+0.5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA培養(yǎng)基對葉片誘導分化能力強。

2.3不同激素配比對鱗片分化的影響

以分化率、叢芽數及芽生長勢為指標， 調整6-BA、NAA

的比例，篩選出最適合誘導不定芽的培養(yǎng)基，鱗片在培養(yǎng)基上培養(yǎng)一段時間后，鱗片基部膨大，15 d后，可見嫩綠色的芽點，25 d后，芽點處形成大小、長短不一的不定芽或叢芽。50、10 mg/L 6-BA培養(yǎng)基中外植體變化緩慢，其中以10 mg/L 6-BA最慢，30 d后仍只見鱗片基部膨大，60 d后其芽分化量少且矮。綜合不定芽生長情況可知，0.5、1.0 mg/L 6-BA等2種培養(yǎng)基較適宜（表2、圖2）。

2.42，4-D濃度對葉片分化能力的影響

2，4-D既可以誘導植物體細胞胚的發(fā)生，也可以抑制體細胞胚的發(fā)育。本試驗中，在僅有2，4-D作為誘導分化激素的培養(yǎng)基中，誘導率都不高。培養(yǎng)75d后，除了2，4-D表160 d鐵炮百合不同部位葉片分化能力0.2 mg/L+6-BA 0 mg/L培養(yǎng)基上有分化外，其余4種培養(yǎng)基均不分化不定芽（表3）。培養(yǎng)10 d后，基部葉片略微膨大，20 d后其上出現少量的愈傷組織，愈傷組織數量逐漸增多，愈傷組織塊逐漸增大（圖3、圖4）。

2.5暗培養(yǎng)與光培養(yǎng)對葉片分化能力的影響

光培養(yǎng)、暗培養(yǎng)對鐵炮百合葉片的分化有明顯影響。在相同的培養(yǎng)基中，暗培養(yǎng)的不定芽分化率顯著高于光培養(yǎng)，且暗培養(yǎng)比光照條件下培養(yǎng)葉片分化叢芽數多，芽也更健壯。所以，暗環(huán)境比光照環(huán)境更有利于葉片分化不定芽。

3結論與討論

有研究表明，NAA 與 6-BA 組合對很多百合品種的不定芽誘導效果較好[6-7]。較高濃度的分裂素與較低的生長素可以促進不定芽的分化[8]。本試驗結果表明，低濃度6-BA下鱗片分化率顯著高于10 mg/L 6-BA 鱗片 的分化率，10 mg/L 6-BA培養(yǎng)基誘導的不定芽數少，誘導率低，且長勢較弱，可能是因為過高的6-BA 抑制了不定芽的分化。以往鐵炮百合組織培養(yǎng)中，多數學者采用鱗片作為外植體，但由于鱗莖長期生長在土壤中，導致病原菌多，以致外植體很難徹底消毒。以葉片或花部等組織作為外植體可以大大降低污染率。

驗結果還表明，葉片不同位置的再生率不同，中部分化不定芽的能力最強，達85.36%，這與王杰等的結論[9]類似。光照條件對外植體分化有很大影響。曹孜義等認為，有的材料適合暗培養(yǎng)，有的適合光培養(yǎng)，暗光更有利于愈傷組織的誘導形成[10]。王杰等認為，光培養(yǎng)對麝香百合胚性愈傷組織長勢、體積增長、增殖系數有顯著的促進作用。本試驗中，暗培養(yǎng)比光照條件更有利于鐵炮百合葉片誘導不定芽。2，4-D常用于誘導愈傷組織與促進其生長[11]。在2，4-D對葉片分化的誘導試驗中，2，4-D 0.2 mg/L+6-BA 0.5 mg/L培養(yǎng)基中，愈傷組織誘導率達80%，遠高于其他濃度組合。本試驗利用2，4-D誘導的葉片形成愈傷組織，不能分化不定芽，可能由于2，4-D抑制體細胞胚的發(fā)育所致[12]。綜上所述，鐵炮百合鱗片的誘導分化能力高于葉片，鱗片分化培養(yǎng)基以MS+0.5 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA、MS+1.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA為宜。葉片分化培養(yǎng)基以MS+1.0 mg/L BA+ 0.2 mg/L NAA為宜。葉片的不同部位對不定芽的誘導影響較大，以葉片中部分化能力最強，分化率為82.36%，上部次之，下部最差。2，4-D濃度對愈傷組織的誘導具有顯著影響，愈傷誘導培養(yǎng)基以MS+0.5 mg/L 6-BA+0.2 mg/L 2，4-D 為佳，愈傷率達80%以上。

參考文獻：

[1]彭昌操，趙小蘭. 麝香百合離體繁殖與移栽技術研究[J].湖北民族學院學報：自然科學版，2000，18（4）：7-9.

[2]譚文澄，戴策剛. 觀賞植物組織培養(yǎng)技術[M]. 北京：中國林業(yè)出版社，1991.

[3]余桂紅，馬鴻翔，周森平，等. 百合農桿菌介導的遺傳轉化受體系統(tǒng)的建立[J]. 江西農業(yè)學報，2004，16（2）：15-19.

[4]劉菊華，金志強，徐碧玉，等. 龍牙百合的植株再生與遺傳轉化[J]. 分子植物育種，2003，1（4）：465-474.

[5]Hoshi Y，Kondo M，Mori S，et al.Production of transgenic lily plants by agrobacterium-mediated transformation[J]. Plant Cell Rep，2004，22：359-364.

[6]張延龍，徐炎，王潔純，等. 東方百合葉片組織培養(yǎng)研究[J]. 西北農林科技大學學報：自然科學版，2004，32（1）：47-50.

[7]張藝萍，屈云慧，熊麗，等. 百合葉片離體不定芽發(fā)生和快繁技術研究[J]. 西北農業(yè)學報，2006，19（4）：751-754.

[8]許潔婷，王月，唐克軒. 麝香百合花部組織離體培養(yǎng)與植株再生[J]. 上海交通大學學報：農業(yè)科學版，2008，26（1）：13-16.

[9]王杰，劉國鋒，包滿珠. 麝香百合胚性愈傷組織狀態(tài)的調整與植株再生[J]. 園藝學報，2008，35（12）：1795-1802.

[10]曹孜義，劉國民. 實用植物組織培養(yǎng)技術教程[M]. 蘭州：甘肅科學技術出版社，2002：238.

[11]王冬梅，黃學林，黃上志. 細胞分裂素類物質在植物組織培養(yǎng)中的作用機制[J]. 植物生理學通訊，1996，32（5）：373-377.

[12]曾泉，徐子勤. 幾種匍匐翦股穎成熟胚愈傷組織誘導及植株再生[J]. 西北植物學報，2006，26（10）：2033-2038.馬義虎，楊祥田，楊子峰，等. 機插連作晚稻品種篩選及其生育特性研究[J]. 江蘇農業(yè)科學，2015，43（2）：58-62.