李朝煒　劉穎　朱昀　劉青　賈慧敏

摘要：以旱稻品種鯤旱1號的種子為材料，研究了不同培養(yǎng)基成分及不同濃度的激素對愈傷組織誘導效率的影響。結(jié)果表明，NB培養(yǎng)基較MS培養(yǎng)基更加有利于旱稻愈傷組織的誘導和繼代培養(yǎng)；當2，4-D濃度為2 mg/L時的愈傷組織出愈率最高；添加脯氨酸不利于鯤旱1號愈傷組織的形成和生長；選用麥芽糖作為碳源可明顯提高愈傷組織的誘導率。

關(guān)鍵詞：旱稻；愈傷組織；成熟胚；誘導

中圖分類號： Q943.1文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2015）02-0052-03

收稿日期：2014-03-17

基金項目：國家轉(zhuǎn)基因生物新品種培育科技重大專項（編號：2011ZX08001-003）。

作者簡介：李朝煒（1979—），女，河北衡水人，博士，講師，從事植物基因工程與分子生物學研究。Tel：（0311）81668495；E-mail：lizhaowei79@163.com。旱稻是適于在旱地種植的栽培稻，屬于水稻的變異型，栽培歷史悠久，可追溯至數(shù)千年前，目前在世界范圍內(nèi)種植面積大約占到稻米總種植面積的12%。旱稻具有耐瘠、耐旱、適應(yīng)性廣的特點，在目前我國水資源短缺及耕地面積不斷減少的嚴峻形勢下具有明顯的發(fā)展優(yōu)勢。干旱缺水已成為制約我國糧食生產(chǎn)的關(guān)鍵性因素[1]，我國人均占有水資源量只有世界人均占有量的四分之一。水稻作為我國重要的糧食作物，其用水量巨大，加之現(xiàn)有選育和推廣的栽培稻品種普遍存在不抗旱的不足，因而水資源短缺已經(jīng)成為嚴重影響水稻產(chǎn)量的原因之一。在此形勢之下，加快選育旱稻新品種，能夠節(jié)約大量農(nóng)業(yè)用水，擴大稻谷種植面積，增加糧食產(chǎn)出渠道，提高農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的經(jīng)濟效益[2]。大力發(fā)展旱稻品種選育，獲得抗逆、優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)的旱稻品種，既可以克服干旱對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的危害，又為培育優(yōu)質(zhì)的稻類新品種提供重要的基礎(chǔ)。通過基因工程的方法對其進行改良是目前的研究熱點[3-8]。胚性愈傷組織作為遺傳轉(zhuǎn)化體系的最常用受體材料，其誘導條件成為稻類組織培養(yǎng)研究的重要方面。本研究以粳水稻、粳旱稻、爪哇稻進行三交雜交育種得到的耐旱高產(chǎn)的粳旱稻品種——鯤旱1號的成熟種子作為材料，研究在不同培養(yǎng)基成分及不同外源激素濃度配比情況下，旱稻愈傷組織的生長狀態(tài)及誘導效率的差異，以期獲得大量適于遺傳轉(zhuǎn)化的優(yōu)質(zhì)愈傷組織，并為進一步建立穩(wěn)定高效的旱稻轉(zhuǎn)化體系奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料

旱稻品種鯤旱1號（由河北鯤鵬種業(yè)提供）的成熟種子作為愈傷組織誘導的材料。

1.2方法

1.2.1愈傷組織誘導培養(yǎng)基配制愈傷組織的誘導培養(yǎng)基以NB培養(yǎng)基（N6大量元素、B5 微量元素、有機元素、鐵鹽）和MS培養(yǎng)基作為基本培養(yǎng)基，再添加一定濃度的激素及適量谷氨酰胺、水解酪蛋白、脯氨酸和蔗糖或麥芽糖等成分。將培養(yǎng)基的pH值調(diào)至5.8，滅菌后倒入無菌培養(yǎng)皿，待凝固后備用。

1.2.2種子滅菌選取適量籽粒飽滿、干凈無霉變的旱稻種子，脫去穎殼，放置在干凈離心管中，先用清水洗2遍，隨后在超凈臺上操作，加入適量75%的乙醇振蕩消毒1 min，然后棄去液體，再加入有效氯濃度為5%的次氯酸鈉溶液和幾滴吐溫20，滅菌2次，每次20 min，期間不斷劇烈振蕩，隨后棄去液體，用無菌水清洗5～6次，轉(zhuǎn)入無菌的三角瓶中浸泡20～30 min，再用無菌水清洗3～5次，將種子撈出，置于放有無菌濾紙的培養(yǎng)皿中吸干水分。

1.2.3愈傷組織的誘導及繼代待種子基本干燥之后，用滅菌的小勺或鑷子將種子均勻分布在不同成分的誘導培養(yǎng)基上，每一個培養(yǎng)皿放置15～20粒，用封口膜將培養(yǎng)皿封好，置于28 ℃培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)。培養(yǎng)3～4 d后種子變得松軟，可見愈傷組織明顯形成，此時可將胚乳部分切去。待培養(yǎng)至7～10 d 時，愈傷組織長至綠豆粒大小，此時將長出的芽切去，再繼續(xù)培養(yǎng)至30 d左右。

1.2.4試驗結(jié)果分析統(tǒng)計接種后每隔3～4 d觀察 1 次，如有污染的種子及時清除。培養(yǎng)30 d后統(tǒng)計出愈率：出愈率=（產(chǎn)生愈傷組織的種子粒數(shù)/接種的種子粒數(shù)）×100%。

2結(jié)果與分析

2.1不同培養(yǎng)基成分對旱稻愈傷組織誘導效率的影響

旱稻品種鯤旱1號愈傷組織的誘導培養(yǎng)分別采用NB和MS培養(yǎng)基作為基礎(chǔ)，采用麥芽糖作為碳源并添加適量激素。結(jié)果顯示，這2種培養(yǎng)基在接種4～5 d后均有愈傷組織開始長出，但誘導效率存在明顯差異，以NB培養(yǎng)基作為基礎(chǔ)時，旱稻的愈傷誘導效率要高于以MS培養(yǎng)基作為基礎(chǔ)時的愈傷誘導效率（表1）。此外，這2種培養(yǎng)基所誘導出的愈傷組織的狀態(tài)也存在差異。NB培養(yǎng)基上的愈傷組織顏色淡黃，顆粒較為致密且形態(tài)圓潤，繼代之后生長狀態(tài)良好；MS培養(yǎng)基上生長的愈傷組織顏色較為暗淡，顆粒松散干癟，且繼代之后容易褐化。由試驗結(jié)果可見，在使用相同外源激素的情況下，培養(yǎng)基對鯤旱1號的愈傷組織出愈率及生長狀態(tài)的影響較大。

2.2不同質(zhì)量濃度激素對旱稻愈傷組織誘導率的影響

在誘導植物組織或器官產(chǎn)生愈傷的過程中，植物激素是影響誘導效率的重要因素[4]。本研究分別試驗了在培養(yǎng)基中添加不同濃度的2，4-D和6-BA，結(jié)果（表2）顯示，在 NB

作為基礎(chǔ)成分的培養(yǎng)基上，2，4-D濃度為2.0 mg/L、6-BA 濃度為0 mg/L 時鯤旱1號成熟種子誘導愈傷組織的效率最高，達到77.3%；而2，4-D濃度為1.0 mg/L、6-BA濃度為1.0 mg/L 時出愈率最低，為36%。將2，4-D的濃度提高到4.0 mg/L時，愈傷誘導率仍然較高，但愈傷組織的結(jié)構(gòu)變得較為細碎，不適于后續(xù)的轉(zhuǎn)化試驗（結(jié)果未顯示），因此在本研究中2，4-D使用濃度以2 mg/L為宜，濃度過高或過低都不利于旱稻愈傷組織的誘導與生長。此外，從表2可以看出，2，4-D是誘導旱稻愈傷所必需的因子，而添加 6-BA 對于鯤旱1號的愈傷誘導并無明顯促進作用，當濃度較大時反而有一定的抑制效果。

2.3脯氨酸對愈傷組織誘導效果的影響

據(jù)文獻報道，在一些植物進行組織培養(yǎng)時添加脯氨酸可提高愈傷的出愈率和生長速率并減少褐化[9-11]。因此在本研究中以NB培養(yǎng)基作為基礎(chǔ)，分別添加不同濃度的外源脯氨酸，每種處理接入100粒種子，27 ℃暗培養(yǎng)30 d后統(tǒng)計愈傷的誘導率及生長狀況。隨后每種處理再分別接入50塊愈傷進行繼代培養(yǎng)，10 d和20 d后分別統(tǒng)計褐化率，結(jié)果（表3）顯示，在進行愈傷誘導時添加較低濃度的脯氨酸（500 mg/L）并沒有明顯改善旱稻愈傷的誘導率和褐化率，當脯氨酸添加濃度達到 1 000 mg/L 及以上時，反而對愈傷組織的生長造成不利影響。不添加脯氨酸時愈傷組織為淡黃色，顆粒致密，生長狀況良好，而添加較高濃度脯氨酸時誘導出的愈傷組織顏色呈現(xiàn)土黃色，且繼代后容易褐化。

2.4不同碳源對愈傷組織誘導效果的影響

糖類作為植物組織培養(yǎng)的常用碳源，具有調(diào)節(jié)代謝、促進生長的重要作用[12]。其中蔗糖一直被廣泛應(yīng)用于多種植物的組織培養(yǎng)，隨著研究領(lǐng)域的不斷拓展，其他糖類對植物組織培養(yǎng)的效應(yīng)引起廣泛關(guān)注。研究表明不同植物對不同糖類的反應(yīng)有所差異，蔗糖并不是針對所有植物材料組織培養(yǎng)的最佳碳源。

近年來，利用麥芽糖作為碳源對植物組織培養(yǎng)的影響效果受到重視。本研究以NB培養(yǎng)基作為基礎(chǔ)，比較了蔗糖和麥芽糖分別作為碳源時愈傷的生長狀態(tài)，結(jié)果見表4。當以蔗糖作為碳源時，誘導出的愈傷出愈率較低，顏色較為暗淡，將碳源換為麥芽糖時，出愈率較高，愈傷為淡黃色且狀態(tài)良好。

3結(jié)論與討論

3.1激素配比對旱稻愈傷組織誘導率的影響

不同稻類的基因型差異是影響其愈傷誘導和遺傳轉(zhuǎn)化效率的重要因素[5]，以往研究結(jié)果顯示，不同旱稻品種的愈傷誘導體系和效率差異較大[11，13-15]，并且由于針對旱稻的研究成果較少，與水稻相比試驗難度較大。為獲得狀態(tài)良好的愈傷組織，為今后進一步建立高效遺傳轉(zhuǎn)化體系建立基礎(chǔ)，本研究針對鯤旱1號成熟種子的適宜愈傷誘導條件進行了摸索。結(jié)果顯示，NB培養(yǎng)基較MS培養(yǎng)基更為適宜旱稻的愈傷誘導；2，4-D作為生長素的一種類似物，是用于誘導植物形成愈傷組織的常用激素，其使用濃度過低或過高均不利于愈傷生成，本研究發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)基中添加2.0 mg/L的2，4-D即可使愈傷組織的誘導率達到最高；6-BA作為第一個人工合成的細胞分裂素，具有多種生理作用，相關(guān)研究證實其在誘導愈傷組織時常與2，4-D配比使用，具有一定的效果，其使用濃度一般多為0.5 mg/L至1.5 mg/L[15-17]，本研究結(jié)果顯示添加 0.5 mg/L 的6-BA對于鯤旱1號的愈傷誘導并無明顯促進作用，當濃度較大時（1.0～1.5 mg/L）反而有一定的抑制效果。

3.2脯氨酸對旱稻愈傷組織的影響

有研究顯示脯氨酸在植株生理代謝及細胞滲透調(diào)節(jié)過程中起重要作用，在誘導培養(yǎng)基中添加適量濃度的脯氨酸能夠增強愈傷組織的代謝活力，促進愈傷組織的生長[9-11]。而本研究發(fā)現(xiàn)當培養(yǎng)基中添加一定濃度脯氨酸時，對旱稻的愈傷誘導和抑制褐化并未有明顯的改善效果，并且加入脯氨酸后形成的愈傷組織為土黃色，質(zhì)地較為細碎干癟且容易褐化，不適于后續(xù)的遺傳轉(zhuǎn)化，分析其原因，可能與旱稻和水稻在細胞內(nèi)源性游離脯氨酸含量、細胞膜通透性等方面的差異有關(guān)[18]。脯氨酸在組織培養(yǎng)體系中的具體作用原理尚不十分明確，它對植物愈傷組織生長的促進效應(yīng)是否具有普遍性還有待進一步研究。

3.3不同碳源對旱稻愈傷組織的影響

碳源是培養(yǎng)基中不可缺少的必要成分，以糖類作為碳源，不僅能夠為細胞提供能量，還可以調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的滲透壓，因此被廣泛應(yīng)用于植物組織培養(yǎng)。不同的糖類其具體生理效應(yīng)也不相同，選擇合適的糖類作為碳源，能夠更好地促進培養(yǎng)物生長，是植物組織培養(yǎng)體系的重要影響因素之一[19-20]。

麥芽糖與蔗糖分子量相同，均為二糖，是植物組織培養(yǎng)體系常用碳源。在針對鯤旱1號的愈傷誘導研究中，麥芽糖作為碳源，對愈傷組織的誘導效果要優(yōu)于蔗糖，其原因可能是多方面的，例如其分解速度慢于蔗糖，可使培養(yǎng)物保持相對穩(wěn)定的滲透壓；也有可能是旱稻組織細胞對麥芽糖的利用能力要好于蔗糖?？傊?，不同植物進行組織培養(yǎng)時最適用的糖類并不相同，在具體研究中需要進行針對性的探索。

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