張志忠等

[摘要] 目的 探討Topo Ⅱ、Ki-67和P53 在Siewert Ⅱ型胃食管結(jié)合部腺癌中的表達(dá)與化療敏感性之間的關(guān)系。方法 回顧性分析本院2010年6月～2013年12月行新輔助化療的胃食管結(jié)合部腺癌患者72例。對(duì)所有患者均行SOX方案化療，以RECIST 1.0評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)評(píng)價(jià)療效。用免疫組化方法評(píng)價(jià)3種蛋白的表達(dá)情況，分析各蛋白表達(dá)情況及與化療療效的關(guān)系。 結(jié)果 年齡和病理類型與化療敏感性無(wú)關(guān)，本組72例患者中新輔助化療有效率為48.6%，其中5例達(dá)病理完全緩解。3種蛋白的表達(dá)情況分別為：Topo Ⅱ陽(yáng)性率為73.6%， Ki-67陽(yáng)性率為59.7%， P53陽(yáng)性率為33.3%。 Ki-67和P53的表達(dá)與化療敏感性有關(guān)（P=0.023，P=0.031），但Topo Ⅱ的表達(dá)與化療敏感性無(wú)關(guān)（P>0.05）。 結(jié)論 Ki-67高表達(dá)和P53低表達(dá)是AGEJ SOX方案新輔助化療敏感性的影響因素，為AGEJ個(gè)體化新輔助化療方案的選擇提供有益的參考。

[關(guān)鍵詞] 胃食管結(jié)合部腫瘤；新輔助化療；Topo Ⅱ； Ki-67；P53；化療敏感性

[中圖分類號(hào)] R737.9 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] B [文章編號(hào)] 1673-9701（2015）04-0113-04

[Abstract] Objective To investigate the expression of Topo Ⅱ， Ki-67， P53 in advanced adenocarcinoma of gastroesophageal junction（AGEJ） and its relationship to sensitivity of neoadjuvant chemotherapy. Methods Clinical data of 72 patients of locally advanced AGEJ between June 2010 and Dec 2013 were analyzed retrospectively. All patients were given SOX neoadjuvant chemotherapy and the responses to treatment were evaluated according to RECIST 1.0. Expressions of 3 proteins were detected by in all patients before neoadjuvant chemotherapy. Detecting the expressions of Topo Ⅱ， Ki-67， P53 by immunohistochemistry is to analyze its relationship to neoadjuvant chemotherapy. Results The chemotherapy sensitivity had no correlation with age and pathological types（P>0.05）. The overall response rates was 48.6%， including complete response in 5 cases and progressive disease in 6 cases.The positive expression rates of Topo Ⅱ， Ki-67 and P53 in AGEJ were 73.6%，59.7% and 33.3%. Ki-67 and P53 were significantly correlated with chemotherapy sensitivity（P=0.003，P=0.020）， while Topo Ⅱ was not correlated with chemotherapy sensitivity（P>0.05）. Conclusion An elevated expression of Ki-67 and depressed expression of P53 are important factors for SOX insensitivity in AGEJ. They may provide an useful reference for designing individualized chemotherapeutic regimens for AGEJ patients.

[Key words] Gastroesophageal junction neoplasms； Neoadjuvant chemotherapy；Topo Ⅱ； Ki-67；P53；Chemosensitivity

近年來(lái)胃食管結(jié)合部腺癌（adenocarcinoma of gastroesophageal junction，AGEJ）的發(fā)病呈增長(zhǎng)趨勢(shì)[1，2]?，F(xiàn)已證實(shí)新輔助化療對(duì)進(jìn)展期胃癌能提高手術(shù)切除率、減少術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移、延長(zhǎng)生存期[3]。但對(duì)于Siewert Ⅱ型胃食管結(jié)合部腺癌新輔助化療的療效針對(duì)性研究較少。尋找可靠的化療敏感性預(yù)測(cè)指標(biāo)、早期篩選出對(duì)化療應(yīng)答不敏感的患者、減少不必要的術(shù)前化療，已成為重要臨床課題之一。結(jié)合既往胃癌方面的研究成果，我們回顧性檢測(cè)3種蛋白質(zhì)：Topo Ⅱ、Ki-67和P53在AGEJ癌活檢標(biāo)本中的表達(dá)，研究化療藥物敏感性的差異，尋找可靠的化療敏感性預(yù)測(cè)指標(biāo)、期望篩選出可能對(duì)SOX方案新輔助化療敏感的預(yù)測(cè)因子，為AGEJ癌的個(gè)體化治療提供重要的依據(jù)。

1資料與方法

1.1一般資料

收集2010年6月～2013年12月在河南省安陽(yáng)市腫瘤醫(yī)院行新輔助化療的72例進(jìn)展期Siewert Ⅱ型AGEJ癌患者。其中男63例，女9例；年齡40～76歲（中位年齡67歲）；治療前臨床分期均為cT3～4Nl～3。術(shù)前病理類型：中、低分化腺癌66例（其中4例伴印戒細(xì)胞癌，7例伴黏液腺癌），高分化腺癌2例，黏液腺癌3例，印戒細(xì)胞癌1例。研究對(duì)象的選擇標(biāo)準(zhǔn)：①胃鏡活檢病理確診為腺癌；②排除遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移；③腹部增強(qiáng)CT顯示局部腫塊侵犯胃壁全層（T3或T4）或有區(qū)域淋巴結(jié)腫大；④所有患者體力狀況（ECOG）評(píng)分為0～2分，且無(wú)嚴(yán)重心、肺、肝、腎等臟器功能異常者；⑤無(wú)其他惡性腫瘤病史及放化療史者；⑥簽署知情同意書(shū)，愿意接受術(shù)前化療及手術(shù)者。

1.2治療方案

所有患者行SOX方案新輔助化療：奧沙利鉑注射液130 mg/m2靜脈滴注2～3 h d1+替吉奧膠囊40～60 mg bid po d1～14。3周后重復(fù)，共2次?；熗瑫r(shí)予以地塞米松、西米替丁、格拉司瓊、苯海拉明等輔助用藥治療。化療結(jié)束后4周進(jìn)行術(shù)前療效評(píng)價(jià)，若無(wú)腫瘤進(jìn)展則行標(biāo)準(zhǔn)胃食管結(jié)合部腺癌根治術(shù)（D2）。術(shù)后給予常規(guī)輔助化療。

1.3 檢測(cè)方法

1.3.1 臨床檢測(cè) 新輔助化療前對(duì)活檢腫瘤組織作3種蛋白檢測(cè)，在新輔助化療前后分別進(jìn)行胃鏡（或超聲胃鏡）、64排增強(qiáng)CT檢查以對(duì)比療效評(píng)價(jià)，手術(shù)者術(shù)后行病理組織學(xué)檢查、療效評(píng)價(jià)。

1.3.2 免疫組化檢測(cè) 標(biāo)本的處理及免疫組織化學(xué)染色：所有標(biāo)本用10%甲醛固定，石蠟包埋，連續(xù)切片厚4 μm。玻片用多聚-L-賴氨酸涂覆，常規(guī)蘇木素-伊紅（HE）染色，確定病理類型。采用檸檬酸緩沖液微波抗原修復(fù)法。實(shí)驗(yàn)試劑：鼠抗人Topo Ⅱ（Ki-S1）、鼠抗人Ki-67（MAB-0129）、鼠抗人P53（DO-7）、即用型單克隆抗體、檢測(cè)試劑盒（KIT-9701）、陽(yáng)性對(duì)照片均購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)公司，操作按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

S-P免疫組織化學(xué)染色方法簡(jiǎn)述如下：石蠟切片經(jīng)常規(guī)二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化；檸檬酸緩沖液高溫高壓抗原修復(fù)；滴加過(guò)氧化酶阻斷液室溫10 min，磷酸鹽緩沖液（PBS） pH=7.2沖洗后滴非免疫性動(dòng)物血清室溫10 min，滴加第1抗體即抗Topo Ⅱ、抗Ki-67、抗p53，4℃冰箱孵育過(guò)夜；PBS沖洗后滴加生物素標(biāo)記的第2抗體室溫10 min；PBS沖洗后滴加鏈霉素親和素-過(guò)氧化物酶溶液室溫10 min，PBS沖洗后二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色，沖冼，蘇木素復(fù)染，封片，顯微鏡觀察。每次實(shí)驗(yàn)用已知陽(yáng)性切片作陽(yáng)性對(duì)照，用PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。Topo Ⅱ、Ki-67、P53蛋白均定位于細(xì)胞核，以細(xì)胞結(jié)構(gòu)中存在粗細(xì)一致的棕黃色顆粒為陽(yáng)性。陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)<50%表示基因低表達(dá)，計(jì)為（-），而≥50%則表示基因高表達(dá)，計(jì)為（+）。以上結(jié)果由2名病理學(xué)專家閱片判斷。

1.4 療效判斷

以新輔助化療前后胃鏡（或超聲胃鏡）、64排增強(qiáng)CT及術(shù)后病理切片作為療效判斷的證據(jù)。新輔助化療后原發(fā)病灶的療效判定根據(jù)RECIST 1.0[4]標(biāo)準(zhǔn)評(píng)估，分為完全緩解（CR）、部分緩解（PR）、疾病穩(wěn)定（SD）、疾病進(jìn)展（PD）。以CR+PR計(jì)算有效率（RR）。毒性反應(yīng)采用NCI-CTC 3.0不良反應(yīng)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)判定[5]。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用SASW18.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，相關(guān)分析采用Logistic多因素回歸分析及Spearman秩相關(guān)處理相關(guān)數(shù)據(jù)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2結(jié)果

2.1 病理特征

分化良好型[6]（包括管狀腺癌、乳頭狀腺癌、高中分化腺癌）38例，分化不良型（低分化腺癌、黏液腺癌、印戒細(xì)胞癌、未分化癌和單純癌）34例。PD患者共6例未行手術(shù)治療，余66例均行R0切除，年齡<65歲者45例，≥65歲者27例?；颊吣挲g、腫瘤分化程度與化療效果關(guān)系見(jiàn)表1。

2.2 治療情況

本組72例患者全部完成新輔助化療SOX三周方案兩個(gè)周期。不良反應(yīng)主要為惡心、嘔吐、粒細(xì)胞減少、血小板減少、外周神經(jīng)毒性，經(jīng)對(duì)癥治療后緩解，未出現(xiàn)Ⅲ度及以上毒副反應(yīng)。新輔助化療后4周行標(biāo)準(zhǔn)胃食管結(jié)合部腺癌根治術(shù)（D2），術(shù)中進(jìn)行腫瘤測(cè)量。術(shù)后并發(fā)癥：3例患者出現(xiàn)吻合口出血，2例患者出現(xiàn)吻合口瘺，均保守治療后治愈。

2.3 新輔助化療結(jié)果及術(shù)后病理結(jié)果

本組66例手術(shù)患者新輔助化療綜合療效判斷：5例CR（6.9%），30例PR（41.7%），31例SD（43.1%）。新輔助化療總有效率RR（CR+PR）為48.6%，顯示對(duì)SOX三周方案化療敏感。術(shù)后病理結(jié)果：5例未見(jiàn)殘留癌細(xì)胞，均為低-中分化腺癌或低分化腺癌，而且不合并黏液腺癌或印戒細(xì)胞癌等其他成分。4例僅見(jiàn)灶狀散在癌細(xì)胞簇，分別為中低分化腺癌、中分化腺癌合并乳頭狀腺癌、低分化腺癌、中分化腺癌。顯示單純中低分化腺癌化療效果較好。術(shù)后病理分期（2010年美國(guó)癌癥聯(lián)合會(huì)（American Joint Committee on Cancer， AJCC）第7版TNM分期標(biāo)準(zhǔn)）[7]：術(shù)后病理9例無(wú)法分期（5例未發(fā)現(xiàn)殘留癌細(xì)胞，4例癌細(xì)胞零散分布，無(wú)法判定T分期），Ⅱ期23例、Ⅲ期34例。

2.4 各個(gè)蛋白檢測(cè)的結(jié)果

各蛋白的表達(dá)與年齡、分化程度無(wú)明顯相關(guān)性（P>0.05）。在72例AGEJ癌標(biāo)本中，3種蛋白的表達(dá)情況及與化療療效的關(guān)系見(jiàn)表2。Topo Ⅱ陽(yáng)性表達(dá)為53例（73.6%），在CR+PR組和SD+PD組之間無(wú)顯著性差異（P>0.05）；Ki-67陽(yáng)性表達(dá)43例（59.7%），在CR+PR組中陽(yáng)性率明顯高于SD+PD組（χ2=8.593，P=0.003）；P53陽(yáng)性表達(dá)24例（33.3%），在CR+PR組中陽(yáng)性率明顯低于SD+PD組（χ2=5.449，P=0.020）。多元回歸結(jié)果顯示Ki-67是影響胃食管結(jié)合部腺癌新輔助化療療效的獨(dú)立因子（P=0.015）。Spearman相關(guān)分析顯示：Topo Ⅱ的表達(dá)與Ki-67的表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.405，P=0.001），而TopoⅡ與P53、Ki-67與P53的表達(dá)之間均無(wú)明顯相關(guān)性（P>0.05）。

3討論

研究表明[8]AGEJ與中遠(yuǎn)段胃癌在臨床病理指標(biāo)及分子標(biāo)記物上存在顯著差異，提示AGEJ與中遠(yuǎn)段胃癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中可能存在不同的分子機(jī)制。新輔助化療在胃癌中受到越來(lái)越多的重視，Li等[9]報(bào)道新輔助化療能顯著改善中國(guó)人局部進(jìn)展期胃癌的治療效果。但將AGEJ單獨(dú)進(jìn)行新輔助化療研究的報(bào)道仍較少。腫瘤細(xì)胞耐藥是降低消化道腫瘤患者生存率的主要原因。如何預(yù)測(cè)AGEJ化療敏感性的問(wèn)題有待解決。如果能找到較為準(zhǔn)確的預(yù)測(cè)新輔助化療敏感性標(biāo)志物.將有助于臨床醫(yī)生根據(jù)腫瘤的分子生物學(xué)特征選擇更有效的治療方案，減少原發(fā)性耐藥的比例，避免不獲益的治療。

本研究中應(yīng)用SOX方案對(duì)AGEJ進(jìn)行新輔助化療，有效率為48.6%，與胃癌的報(bào)道基本相似[10]，達(dá)到了降期、提高R0切除率的目的。本組72例患者新輔助化療不良反應(yīng)主要為惡心、嘔吐、粒細(xì)胞減少、血小板減少、外周神經(jīng)毒性，經(jīng)相應(yīng)治療后緩解，不良反應(yīng)均在可控制范圍內(nèi)；術(shù)后并發(fā)癥僅有3例吻合口出血、2例吻合口瘺，提示新輔助化療是安全的，并未增加手術(shù)并發(fā)癥及手術(shù)風(fēng)險(xiǎn)。化療效果與年齡、分化程度無(wú)明顯相關(guān)性。

本文回顧性研究了Topo Ⅱ、Ki-67和P53在胃食管結(jié)合部腺癌新輔助化療前的表達(dá)，探討其與化療敏感性的關(guān)系。腫瘤細(xì)胞中Topo Ⅱ表達(dá)的增強(qiáng)可以提高以DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶為靶點(diǎn)的抗腫瘤藥物的抗癌效果[11]。其含量下降及酶活性的改變引起易解離復(fù)合物形成減少，導(dǎo)致DNA損傷減少而致藥物耐受。在本研究中Topo Ⅱ的表達(dá)與化療效果之間無(wú)明顯相關(guān)，與在部分胃癌輔助化療中研究[12，13]相一致，其表達(dá)尚不能預(yù)測(cè)SOX方案在胃食管結(jié)合部腺癌新輔助化療的作用。Ki-67是一種細(xì)胞核抗原，僅在增殖細(xì)胞核中表達(dá)，與細(xì)胞的合成代謝有關(guān)， 其表達(dá)水平能較全面客觀地反映腫瘤細(xì)胞的增殖狀態(tài)，是較為理想的檢測(cè)細(xì)胞增殖活性的抗體。研究已證實(shí)[14，15]，Ki-67是判斷腫瘤患者化療療效的重要指標(biāo)。本研究的結(jié)果顯示：Ki-67的表達(dá)與化療敏感性有關(guān)，Ki-67高表達(dá)患者對(duì)化療敏感，療效優(yōu)于低表達(dá)患者，并且多因素回歸分析顯示，Ki-67是獨(dú)立的化療敏感性影響因素。突變型P53基因是促癌基因，當(dāng)該基因發(fā)生突變時(shí)，對(duì)細(xì)胞凋亡的調(diào)控作用受阻，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物產(chǎn)生耐受性。本組結(jié)果顯示，P53表達(dá)陽(yáng)性者新輔助化療有效率明顯低于表達(dá)陰性者，與胃癌[13，16]的研究結(jié)果相似。Ki-67的表達(dá)與Topo Ⅱ的表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.405，P=0.001），而Ki-67與P53表達(dá)無(wú)明顯相關(guān)性（r=-0.090，P=0.49）。

總之，本研究應(yīng)用免疫組化檢測(cè)了3種蛋白在AGEJ中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)Ki-67和P53與化療敏感性有關(guān)，可作為評(píng)估化療預(yù)后的因子。

[參考文獻(xiàn)]

[1] Wijnhoven BP，Louwman MW，Tilanus HW，et al. Increased incidence of adenocarcinomas at the gastro-esophageal junction in Dutch males since the 1990s[J]. Eur J Gastroenterol Hepatol，2002，14（2）：115-122.

[2] Sihvo EI，Salminen JT，Ramo OJ，et al. The epidemiology of esophageal adenocarcinoma： Has the cancer of gastric cardia an influence on the rising incidence of esophageal adenocarcinoma[J]. Scand J Gastroenterol，2000，35（10）：1082-1086.

[3] 季加孚，季鑫. 胃癌新輔助化療的現(xiàn)狀與展望[J]. 中國(guó)腫瘤臨床，2012，39（20）：1458-1461.

[4] Therasse P，Arbuck SG，Eisenhauer EA，et al. New guidelines to evaluate the response to treatment in solid tumors[J].J Natl Cancer Inst，2000，92（3）：205-216.

[5] Trotti A，Colevas AD，Setser A，et al. CTCAE v3.0： Development of a comprehensive grading system for the adverse effects of cancer treatment[J]. Semin Radiat Oncol，2003， 13（3）：176-181.

[6] 趙曉龍，朱兆華，黃開(kāi)紅，等. 胃癌患者臨床預(yù)后及病理因素與瘦素表達(dá)的相關(guān)性研究[J]. 中華實(shí)驗(yàn)外科雜志，2004，21（5）：524-526.

[7] Rice TW，Rusch VW，Ishwaran H，et al. Cancer of the esophagus and esophagogastric junction：Data-driven staging for the seventh edition of the American Joint Committee on Cancer/International Union Against Cancer Cancer Staging Manuals[J]. Cancer，2010，116（16）：3763-3773.

[8] 葉延偉，師英強(qiáng)，王春萌，等. 賁門(mén)癌與胃竇部癌的臨床病理指標(biāo)及免疫組化指標(biāo)差異性分析[J]. 中華醫(yī)學(xué)雜志，2009，89（14）：962-966.

[9] Li ZY，Koh CE，Bu ZD，et al. Neoadjuvant chemotherapy with FOLFOX： improved outcomes in Chinese patients with locally advanced gastric cancer[J]. J Surg Oncol，2012， 105（8）：793-799.

[10] 李濤，陳凜. SOX方案新輔助化療應(yīng)用于進(jìn)展期胃癌的有效性和安全性研究[J]. 中華胃腸外科雜志，2011，14（2）：104-106.

[11] Kim JS，Amorino GP，Pyo H，et al. Radiation enhancement by the combined use of topoisomerase Ⅰ inhibitors，RFS-2000 or CPT-11，and topoisomerase Ⅱ inhibitor etoposide in human lung cancer cells[J]. Radiother Oncol，2002，62（1）：61-67.

[12] 宋延強(qiáng)，李揚(yáng)，林惠忠，等. 胃癌新輔助化療前后多藥耐藥基因的表達(dá)及其與化療敏感性的關(guān)系[J]. 中華普通外科雜志，2009，24（5）：365-367.

[13] 曲建軍，石毅然，郝風(fēng)云，等. 進(jìn)展期胃癌新輔助化療療效預(yù)測(cè)因子的臨床研究[J]. 中華胃腸外科雜志，2013， 16（3）：276-280.

[14] Xu JM，Azzariti A，Tommasi S，et al. Combination of 5-fluorouracil and irinotecan on modulation of thymidylate synthase and topoisomerase I expression and cell cycle regulation in human colon cancer LoVo cells： clinical relevance[J]. Clin Colorectal Cancer，2002，2（3）：182-188.

[15] 劉揚(yáng)，龐達(dá). 乳腺癌新輔助化療前后Ki-67、HER-2、ER和PR的變化與臨床緩解率的關(guān)系[J]. 實(shí)用腫瘤學(xué)雜志，2011，25（5）： 442-445.

[16] Kamoshida S，Suzuki M，Shimomura R，et al. Immunostaining of thymidylate synthase and p53 for predicting chemoresistance to S-1/cisplatin in gastric cancer[J]. Br J Cancer，2007，96（2）：277-283.

（收稿日期：2014-12-08）