王　芳，楊　莎，郭　峰，孟靜靜，孟慶偉，萬書波，李新國,*

1 山東農(nóng)業(yè)大學生命科學學院，泰安 271018 2 山東省農(nóng)業(yè)科學院生物技術研究中心和山東省作物遺傳改良與生態(tài)生理重點實驗室，濟南　250100

鈣對花生幼苗生長、活性氧積累和光抑制程度的影響

王芳1,2，楊莎2，郭峰2，孟靜靜2，孟慶偉1，萬書波2，李新國2,*

1 山東農(nóng)業(yè)大學生命科學學院，泰安 271018 2 山東省農(nóng)業(yè)科學院生物技術研究中心和山東省作物遺傳改良與生態(tài)生理重點實驗室，濟南250100

花生; 鈣; 高溫強光; 光抑制; 活性氧

花生是我國重要的油料作物和經(jīng)濟作物，在油料作物中的種植面積僅次于油菜，居第二位。鈣是植物生長必須的營養(yǎng)元素之一，大部分的鈣被認為與膜和大分子有關[1]，也有大量證據(jù)表明它還參與植物不同的抗逆途徑[2]。花生是喜鈣作物，缺鈣容易引起花生莢果空秕，花生產(chǎn)量降低[3]。我國北方6至9月份是花生莢果發(fā)育的重要時期，高溫和強光往往會引起花生葉片光抑制，影響了花生光合產(chǎn)物的積累，進而影響莢果的發(fā)育，尤其是在其它環(huán)境脅迫條件(如干旱等)下，光合作用的光飽和點會明顯降低，中午的強光高溫更容易引起植物的光抑制，因此研究鈣離子(Ca2+)參與花生抗高溫強光的機制，對花生生產(chǎn)具有重要的理論指導意義。

1　材料與方法

1.1材料與設計

以花生品種花育22為試驗材料，首先挑選飽滿均勻的花生種子在30℃濕潤的條件下催芽1 d，然后挑選發(fā)芽一致的種子，播種于直徑為25 cm 、高15 cm的花盆中，培養(yǎng)基質(zhì)為用純凈水洗凈的石英砂，每盆一株，每9個花盆置于一個托盤中，分別將改良的Hoagland 營養(yǎng)液(Ca2+用Ca(NO3)2進行配置，并用NH4NO3平衡氮元素)澆于托盤中(試驗過程中全部托盤大小一致)，使水分從盆底部侵潤石英砂。Ca2+濃度分為0 mmol/L(CK)、6 mmol/L(C6)和12 mmol/L(C12)3個處理，每個處理3次重復，各處理同時澆相應濃度營養(yǎng)液且用量相同以保持石英砂不干燥。培養(yǎng)室內(nèi)光照強度為300 μmol m-2s-1，晝/夜溫度為26℃/23℃，濕度60%，光照/黑暗周期為14 h/10 h。培養(yǎng)至20 d左右，每種處理均選取生長一致的花生幼苗為材料。

高溫強光脅迫處理時，將倒三葉葉片懸浮于42 ℃與培養(yǎng)溶液濃度一致的溶液上，上方罩有帶有隔熱水槽，對其進行強光處理，光照強度為1200 μmol m-2s-1。

8:00—9:00進行樣品取樣，將植株按地上部、根、葉片等器官分開制備成待測樣品。

1.2測定方法

1.2.1Ca2+含量的測定

選取植株的倒三葉和整個根系放在105 ℃烘箱內(nèi)烘干，然后轉(zhuǎn)到80 ℃烘箱內(nèi)烘至恒重，用原子能吸收法測定根系和葉片中鈣離子的含量，不同Ca2+濃度處理植株的根和葉中，Ca2+含量均出現(xiàn)明顯不同(表1)。

表1不同Ca2+濃度培養(yǎng)的花生植株中根系和葉片的Ca2+含量

Table 1The content of Ca2+in peanut roots and leaves cultivated with different Ca2+concentration

Ca2+濃度/(mmol/L)Ca2+concentrationCa2+在不同組織中的相對含量/%RelativecontentofCa2+indifferenttissues根Root葉Leaf01.01±0.02c0.22±0.03c61.27±0.02b0.31±0.02b121.35±0.03a0.47±0.06a

數(shù)據(jù)為3 次重復的平均值與標準方差，不同的小寫字母表示在0.05水平上差異顯著

1.2.2葉綠素熒光測定

根據(jù)Qin等[9]的方法用便攜式熒光儀(FMS2, Hansatech, 英國)測定PSⅡ最大光化學效率(Fv/Fm)，處理之前材料暗適應2 h以上，每個處理選取15個葉片作為重復，脅迫過程中測定時暗適應5 min后進行測定。

Fv/Fm=(Fm-Fo)/Fm

式中,Fo為初始熒光，F(xiàn)m為最大熒光，F(xiàn)v為可變熒光。

光化學猝滅(qP)通過以下公式進行計算：

qP= (Fm′ -Fs)/(Fm-Fo′)

式中,Fm′光適應條件下的最大熒光，F(xiàn)s是穩(wěn)態(tài)熒光，F(xiàn)o′是光適應條件下的初始熒光[9]。

1.2.4酶活性的測定

總酶液的提取按Cho和Park[14]的方法。超氧化物歧化本酶(SOD)酶活性的測定參見Beyer和Fridovich[15]的方法，過氧化氫酶(CAT)活性的測定參見Aebi[16]的方法，抗壞血酸過氧化物酶(APX)酶活性的測定參見Nakano和Asada[17]的方法。

1.3數(shù)據(jù)處理與方法

采用sigmaplot10.0 和 SPSS18.0進行統(tǒng)計分析和做圖，并進行方差分析。

2　結(jié)果與分析

2.1Ca2+對花生幼苗生長的影響

不同Ca2+濃度培養(yǎng)明顯影響了花生幼苗的生長。CK植株生長明顯偏差(表2)，CK、C6和C12的株高、植株鮮重、植株干重依次升高。C6和C12的株高與CK相比均達極顯著差異，分別增加了11.6%和18.7%，但C6與C12的株高相比差異不顯著；C6和C12的植株鮮重分別比CK增加了33.4%和58.7%，達極顯著差異，根冠比分別降低了2.9%和17.6%；C6和C12的地上部干重和根系干重與CK相比均差異顯著，但C6和C12之間根系干重差異不顯著。C6的根冠比與CK無差異，而C12的根冠比明顯低于CK，達顯著差異。

表2　Ca2+對花生幼苗生長的影響Table 2　Effects of Ca2+ on peanut seedlings′ growth

數(shù)據(jù)為3 次重復的平均值與標準方差，不同的小寫字母表示在0.05水平上差異顯著

2.2Ca2+對花生根系和葉片的ROS積累的影響

培養(yǎng)室環(huán)境條件下，不同Ca2+濃度對花生幼苗植株的根系活力影響顯著，C6和C12的根系活力分別比CK提高了26.0% 和90.4%，同時二者根系SOD酶活性比CK分別提高了31.2%和78.6%(圖1)。

圖1　非脅迫條件下，不同Ca2+濃度培養(yǎng)的花生幼苗植株的根系活力和根系超氧化物歧化酶(SOD)酶活性Fig.1　Effects of different Ca2+ concentrations on root activity and root Superoxide dismutase (SOD) activity of peanut seedlings under non-stress conditions mean ± SD，n=3

圖2　非脅迫條件下，不同Ca2+濃度培養(yǎng)的花生幼苗植株的根系和葉片的ROS積累情況Fig.2　Effects of different Ca2+ concentrations on the accumulation of ROS in roots and leaves under non-stress conditions

2.3高溫強光脅迫下Ca2+對花生幼苗葉片的保護作用

2.3.1Ca2+對花生葉片光抑制程度的影響

Fv/Fm可以作為衡量PSⅡ光抑制程度的指標。如圖3所示，高溫(42℃)強光(1200 μmol m-2s-1)脅迫下，CK、C6和C12葉片的Fv/Fm均明顯下降，三者的下降幅度分別為30.0%、23.5%和23.1%。1-qP反映PSⅡ反應中心的關閉程度和光化學反應能力，1-qP越高，說明PSⅡ反應中心的開放程度越低，光化學反應能力下降。在整個高溫強光脅迫過程中C6和C12葉片的1-qP與CK相比始終處于較低水平(圖3)。

圖3　高溫(42℃)強光(1200 μmol m-2 s-1)脅迫下，Ca2+對葉片的光抑制和PSⅡ初級電子受體(QA)的還原程度的影響Fig.3　Effects of Ca2+ on photoinhibition and QA reduction in peanut leaves under high temperature (42℃) and high irradiance (1200 μmol m-2 s-1)

2.3.2Ca2+對花生葉片的ROS積累及活性氧清除酶活性的影響

高溫強光脅迫下，CK、C6和C12葉片的活性氧清除酶活性均出現(xiàn)升高，C6和C12的SOD、APX和CAT酶活性明顯高于CK(圖5)，脅迫5 h后，CK、C6和C12的SOD酶活性分別為116.57、129.57 U/g鮮重和129.63 U/g鮮重，APX酶活性分別為22.60、27.00 ΔA290/min g鮮重和29.80ΔA290/min g鮮重，CAT酶活性分別為48.38、53.70 ΔA240/min g鮮重和55.80 ΔA240/min g鮮重。這表明Ca2+提高了花生幼苗植株中活性氧清除酶活性。

圖4　高溫(42℃)強光(1200 μmol m-2 s-1)脅迫下， Ca2+對花生葉片中的產(chǎn)生速率與H2O2的含量的影響Fig.4　Effects of Ca2+ on production rate and content in peanut leaves under high temperature (42℃) and high irradiance (1200 μmol m-2 s-1) mean ± SD，n=3

圖5　高溫(42℃)強光(1200 μmol m-2 s-1)脅迫下，Ca2+對花生葉片中超氧化物歧化酶(SOD)、抗壞血酸過氧化物酶(APX)和過氧化物酶(CAT)酶活性的變化Fig.5　Effects of Ca2+ on activity of superoxide dismutase (SOD)、ascorbate peroxidase (APX) and catalase (CAT) in peanut leaves under high temperature (42℃) and high irradiance (1200 μmol m-2 s-1)mean ± SD，n=3

2.3.3Ca2+對葉片滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的含量與膜脂過氧化的影響

隨著處理時間的延長，保護性物質(zhì)呈現(xiàn)逐漸增加的趨勢(圖6)，高溫脅迫后與脅迫前相比，CK、C6和C12可溶性糖的含量分別增加了25.80%、51.50%和66.67%，Pro含量分別增加了262.93%、517.22%和565.27%。這表明Ca2+會促進高溫強光脅迫下花生葉片滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的積累。

花生葉片中AsA含量始終以C12最高，CK最低，且在高溫強光脅迫下，AsA含量在CK、C6和C12幼苗葉片中均整體呈現(xiàn)增加趨勢。正常培養(yǎng)條件下，C6和C12的AsA含量分別比CK高11.1%和19.8%，脅迫后C6和C12的AsA含量則分別比CK高8.8%和10.3%，(圖6)。表明Ca2+有利于提高高溫強光脅迫下AsA的含量。

MDA是植物受到逆境脅迫時膜脂過氧化作用的最終產(chǎn)物，其含量的高低反映ROS對植物細胞膜傷害的程度。正常培養(yǎng)條件下，C6和C12幼苗葉片的MDA 含量明顯低于CK葉片，而在高溫強光脅迫后，CK、C6和C12幼苗葉片的MDA 含量均出現(xiàn)明顯升高，但仍以CK的MDA 含量最高，其次是C6，C12的最低(圖6)，表明高溫強光脅迫下，花生Ca2+對花生葉片膜系統(tǒng)起到了明顯保護作用，而這種保護作用可能與葉片活性氧的有效清除有關(圖4)。

圖6　高溫(42℃)強光(1200 μmol m-2 s-1)脅迫下，Ca2+對花生葉片中可溶性糖、脯氨酸(Pro)、抗壞血酸(AsA)和丙二醛(MDA)含量的變化Fig.6　Effects of Ca2+ on the content of soluble sugar, proline (Pro), ascorbate acid (AsA) and malonaldehyde (MDA) in peanut leaves under high temperature (42℃) and high irradiance (1200 μmol m-2 s-1)mean ± SD，n=3

3　討論

Ca2+對植物生長的影響是多方面的，它參與植物大部分的代謝途徑。施Ca2+會明顯促進花生幼苗的生長，花生植株長勢明顯增強，植株的干重和鮮重都明顯增加，而且12 mmol/L Ca2+濃度似乎對花生幼苗的生長更有利(表2)。

在本研究中，Ca2+促進花生幼苗生長原因與施Ca2+抑制ROS的過量積累密切相關。ROS是生物體維持正常生命活動所必須的，植物在進行呼吸作用和光合電子傳遞時體內(nèi)也會產(chǎn)生ROS，但是如果ROS產(chǎn)生與清除過程的平衡被打破，ROS會大量積累，而ROS具有很高的氧化活性，會對植物體造成傷害[18]。非脅迫條件下，Ca2+促進花生幼苗的生長與施Ca2+提高了ROS的清除能力有關，根系和葉片SOD酶活性顯著提高，有效地降低了活性氧積累所引起的傷害(圖2)，從而使花生根系保持較高的活力(圖1)。

另外，即使在高溫強光脅迫條件下，施Ca2+也會抑制花生幼苗葉片ROS的積累(圖4,圖5)。逆境條件下，植物的光合作用光飽和點會明顯降低，光能利用效率下降，造成光能過剩，從而使PSI和PSⅡ的ROS產(chǎn)生加速。為避免光氧化脅迫，葉綠體通過多種酶促反應和抗氧化劑清除活性氧[4]。ROS的大量積累一方面會直接氧化破壞PSⅡ而加重光抑制，另一方面通過抑制光破壞的PSⅡ的修復而加速光抑制過程[19]。前期的研究表明高溫強光容易引起花生葉片的光抑制，且PSⅡ反應中心的受體側(cè)易受到影響，而對花生葉片光系統(tǒng)造成嚴重破壞的主要原因與能量耗散途徑受抑有關[20]。研究表明，高溫強光脅迫下Ca2+提高了花生葉片的ROS清除能力，對PSⅡ反應中心起到了有效的保護作用，使PSⅡ反應中心保持較大的開放程度，而且12 mmol/L Ca2+濃度對花生幼苗葉片光化學活性的提高比6 mmol/L Ca2+濃度更有效(圖3)。

除ROS清除系統(tǒng)外，植物還擁有多種低抗外界脅迫的保護機制，滲透調(diào)節(jié)就是其中的一個。Pro和可溶性糖是植物體內(nèi)重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，當植物受到環(huán)境脅迫時Pro和可溶性糖的含量增加可以提高植物的抗逆境能力。Ca2+有效提高了花生幼苗的重要保護性物質(zhì)可溶性糖、Pro和AsA的含量(圖6)，從而在一定程度上對生物膜起到了保護作用，降低了生物膜的膜脂過氧化水平(圖6)。AsA既是葉黃素循環(huán)中VDE酶必不可少的底物[21]，也是植物組織中清除活性氧的重要物質(zhì)[4]。Xu等[21]的研究表明，外源AsA能夠增強了葉黃素循環(huán)的運轉(zhuǎn)，提高水稻葉片光合機構(gòu)對低溫和強光所誘導光抑制的抗性[20]，而Ca2+很可能通過提高AsA的含量增強了葉黃素循環(huán)，促進了因高溫強光引起的過剩能量的耗散。另外，Ca2+有效提高花生重要滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的含量表明Ca2+不但可以調(diào)控光合作用機構(gòu)的穩(wěn)定性和ROS清除酶活性，也能直接或間接調(diào)控滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的合成。

Ca2+作為大量元素，其對植物體生長的影響主要集中于兩個方面：一方面Ca2+參與生物膜的形成并與膜的穩(wěn)定性有關[1]。本研究中采用的6 mmol/L Ca2+濃度遠高于Hoagland溶液的4 mmol/L Ca2+濃度，6 mmol/L濃度不會影響花生的正常生長，但在此濃度下花生生長和抗逆境的能力明顯低于12 mmol/L Ca2+濃度，這表明Ca2+對花生幼苗生長的影響不僅僅局限于參與生物膜的形成和其穩(wěn)定性方面；另一方面Ca2+提高植物的適應能力主要是通過Ca2+依賴的信號轉(zhuǎn)導途徑激活下游基因表達或者是激活一系列的生化反應來實現(xiàn)的[2]。植物已知鈣感受器/介質(zhì)具有顯著多樣性和豐富性，包括許多所謂的CaM-like蛋白[22]，這些蛋白家族成員定位于過氧化物酶體和線粒體，葉綠體也擁有許多CaM的潛在靶位[23]。已經(jīng)表明植物的CaM可通過與過氧化氫酶結(jié)合以提高該酶的氧化活性[24]。因此，Ca2+依賴的信號轉(zhuǎn)導途徑可能是調(diào)控花生生長和抗逆性的一個重要途徑，而Ca2+信號轉(zhuǎn)導途徑是如何進行調(diào)控的需要研究。

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Effects of calcium on peanut (ArachisHypogaeaL.) seedling growth,accumulation of reactive oxygen species and photoinhibition

WANG Fang1,2, YANG Sha2, GUO Feng2, MENG Jingjing2, MENG Qingwei1, WAN Shubo2, LI Xinguo2,*

1CollegeofLifeScience,ShandongAgriculturalUniversity,Tai′an,Shandong271018,China2BiotechnologyResearchCenterofShandongAcademyofAgriculturalSciences;ShandongProvincialKeyLaboratoryofCropGeneticImprovement,EcologyandPhysiology,Ji′nan250100,China

peanut; calcium; high temperature and high irradiance; photoinhibition; reactive oxygen species.

山東省自然科學基金項目(ZR2009DZ007, ZR2011CQ042); 山東省自主創(chuàng)新成果轉(zhuǎn)化重大專項(2012ZHZXIA0418- 4); 現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術體系建設專項資金資助(CARS- 14)

2013- 05- 07;

日期:2014- 04- 17

10.5846/stxb201305070965

*通訊作者Corresponding author.E-mail: lixinguo@tom.com

王芳，楊莎，郭峰，孟靜靜，孟慶偉，萬書波，李新國.鈣對花生幼苗生長、活性氧積累和光抑制程度的影響.生態(tài)學報,2015,35(5):1496- 1504.

Wang F, Yang S, Guo F, Meng J J, Meng Q W, Wan S B, Li X G.Effects of calcium on peanut (ArachisHypogaeaL.) seedling growth, accumulation of reactive oxygen species and photoinhibition.Acta Ecologica Sinica,2015,35(5):1496- 1504.