王化修，田道法，吳新正，呂小元，孫劍光( 邵陽醫(yī)學高等專科學校,湖南邵陽4000； 湖南中醫(yī)藥大學； 湖南省第二人民醫(yī)院)

鼻咽癌癌前病變小鼠鼻咽黏膜上皮組織Cx43、Cx32、Cx26的表達變化

王化修1，田道法2，吳新正3，呂小元1，孫劍光1(1 邵陽醫(yī)學高等?？茖W校,湖南邵陽422000；2 湖南中醫(yī)藥大學；3 湖南省第二人民醫(yī)院)

摘要：目的觀察鼻咽癌癌前病變小鼠鼻咽黏膜上皮組織間隙連接蛋白(Cx)43、32、26及其mRNA的表達變化。方法 TgN(p53mt-LMP1)/HT轉基因陽性小鼠(轉基因組) 、同品系C57BL/6J野生小鼠(野生組)各36只，其中每組12、15、18月齡各12只。取小鼠鼻咽黏膜組織，采用免疫組化法、Western blot法檢測鼻咽黏膜上皮中的Cx43、Cx32、Cx26蛋白；RT-PCR法檢測Cx43、Cx32、Cx26 mRNA。結果 轉基因組各月齡小鼠鼻咽黏膜上皮中Cx43、Cx32、Cx26 mRNA及其蛋白相對表達量均低于野生組；轉基因組內，15、18月齡小鼠Cx43、Cx32、Cx26 mRNA及其蛋白相對表達量低于12月齡小鼠(P均<0.05)。結論鼻咽癌癌前病變小鼠鼻咽黏膜上皮中Cx43、Cx32、Cx26 mRNA及其蛋白表達水平下降，其可能與鼻咽癌癌前病變的發(fā)生有關。

關鍵詞：鼻咽癌；癌前病變；轉基因鼠；間隙連接蛋白

研究表明，細胞間隙連接通訊(GJIC)功能缺陷、間隙連接蛋白(Cx)異常表達與多數(shù)腫瘤的惡性增殖有關[1～5]，GJIC異?？赡苁羌毎┳兊闹匾獧C制之一。Cx的快速構象變化及翻譯后化學修飾(磷酸化作用)、細胞質中Cx池與細胞表面的黏附分子等可直接或間接影響GJIC的功能。2012年6月～2013年12月，我們制作了鼻咽癌癌前病變小鼠模型，觀察鼻咽黏膜上皮組織Cx43、Cx32、Cx26 mRNA及其蛋白的表達變化，并探討其意義。

1材料與方法

1.1實驗動物與處理G10代TgN(p53mt-LMP1)/HT轉基因陽性小鼠36只(轉基因組)為本課題組制備和繁殖[6]，12、15、18個月齡各12只，雌雄各半。同品系同齡C57BL/6J健康野生小鼠36只(野生組)購自中國醫(yī)學科學院實驗動物研究所，12、15、18個月各12只雌雄各半。小鼠飼養(yǎng)于IVC 獨立送風籠具，室溫(23±1)℃，濕度50%±10%，采用12 h∶12 h明暗光照。處死小鼠，取小鼠鼻咽黏膜上皮組織，每一標本分為兩份，一份用液氮速凍后存入-70 ℃低溫冰箱待Western blot、RT-PCR檢測；另一份以4%多聚甲醛固定，脫水后石蠟包埋供病理組織學檢查及免疫組化檢測。

1.2檢測項目

1.2.1鼻咽黏膜上皮組織Cx43、Cx32、Cx26表達①免疫組化法：根據(jù)病理組織學觀察所示，選取典型病變標本4 μm厚連續(xù)切片，采用免疫組化SP法檢測Cx43、Cx32、Cx26蛋白；著色部位在細胞質，少數(shù)在細胞膜，每張切片在光鏡下隨機觀察5個高倍視野，各計數(shù)100個細胞，計算陽性細胞百分比；陽性細胞百分比<5%計0分，5%～25%計1分，26%～50%計2分，51%～75%計3分，75%以上計4分；按染色強度計分，無著色計0分，淺黃色計1分，棕黃色計2分；兩者乘積為0為陰性，≥1為陽性。②Western blot法：取出凍存的鼻咽黏膜組織標本，按試劑盒說明書操作，Image proplus6.0圖像分析軟件測算電泳條帶的光密度值(OD值)，以β-actin作為內參，計算相對表達量。

1.2.2鼻咽黏膜上皮組織Cx43、Cx32、Cx26 mRNA表達采用RT-PCR法。用Trizol試劑提取總RNA。引物設計由上海生工生物工程有限公司完成(引物序列及目標片段長度見表1)。PCR反應體系：反應總體積25 μL包括cDNA第一鏈 2 μL，P1及P2引物1 μL，2 mmol/L dNTP 2 μL，10×PCR 反應緩沖液2.5 μL，2.5 mmol/L MgCl22 μL，5 U/μL Taq DNA聚合酶0.25 μL。反應條件：94 ℃預變性3 min，94 ℃變性30 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共進行32個循環(huán)后，以72 ℃延伸10 min。PCR擴增產(chǎn)物行0.1 μg/mL EB、20 g/L瓊脂糖電泳，天能凝膠成像儀攝片。用Image proplus6.0圖像分析軟件測算電泳條帶的OD值，計算相對表達量。

表1　Cx43、Cx32、Cx26 mRNA引物序列及目的片段長度

2結果

2.1鼻咽黏膜上皮組織Cx43、Cx32、Cx26蛋白表達轉基因組各月齡小鼠Cx43、Cx32、Cx26蛋白相對表達量均低于野生組；轉基因組內，15、18月齡小鼠Cx43、Cx32、Cx26蛋白相對表達量低于12月齡小鼠(P均<0.05)。見表2。

表2　各組小鼠鼻咽黏膜上皮組織Cx43、Cx32、

注：與同月齡野生組相比，△P<0.05；與同組12月齡小鼠相比，*P<0.05。

2.2鼻咽黏膜上皮組織Cx43、Cx32、Cx26 mRNA表達轉基因組各月齡小鼠Cx43、Cx32、Cx26 mRNA相對表達量均低于野生組；轉基因組內，15、18月齡小鼠Cx43、Cx32、Cx26 mRNA相對表達量低于12月齡小鼠(P均<0.05)。見表3。

表3　各組小鼠鼻咽黏膜上皮組織Cx43、Cx32、

注：與同月齡野生組相比，△P<0.05；與同組12月齡小鼠相比，*P<0.05。

3討論

細胞間的GJIC功能被認為在控制細胞生長和保持細胞數(shù)量穩(wěn)態(tài)方面具有重要作用。GJIC的結構基礎為間隙連接(GJ)。GJ是一類形成于相鄰細胞間的連接復合體，其結構單位是連接子，每個連接子由6個呈啞鈴狀的蛋白亞單位即Cx聚集而成[7～9]。腫瘤細胞GJIC功能的缺失伴隨特定組織Cx基因表達下調；相反，當Cx基因表達上調時，將抑制腫瘤細胞生長。

Cx43是Cx基因家族中數(shù)量最為豐富的成員[10]。研究發(fā)現(xiàn)，Cx43的表達強度與細胞增殖活性呈負相關，Cx43表達不足，細胞間的信息交流減弱或被阻斷，細胞喪失接觸抑制，出現(xiàn)惡性增殖。文獻報道，多種腫瘤如神經(jīng)膠質瘤、肺癌、乳腺癌、腎癌、胃癌、前列腺癌、皮膚癌、卵巢癌、宮頸癌、喉癌等組織中均存在Cx43表達減少或缺失[11]。Cx26于核糖體合成，定位于細胞膜，形成六聚體，經(jīng)半通道對接偶合組成完整的間隙連接，發(fā)揮間隙通信功能[12]。有學者將Cx26基因轉入Cx26基因表達下調或缺失的肝癌細胞，Cx26蛋白表達恢復，正常的GJIC得到重建，腫瘤細胞生長受到抑制，并出現(xiàn)細胞分化現(xiàn)象，肝癌細胞惡性表型在一定程度上得到逆轉[13]。研究發(fā)現(xiàn)，在腫瘤發(fā)生過程中，Cx32基因表達下調的發(fā)生早于Cx26基因[14]，提示Cx26與Cx32基因在肝癌的發(fā)生過程中作用不盡相同。Moennikea等[15]建立了Cx32基因缺陷的小鼠模型，發(fā)現(xiàn)這類小鼠肝臟再生能力降低，在化學誘變劑作用下易發(fā)生肝癌。有研究表明[16]，鼻咽癌細胞中Cx43、Cx45、Cx32、Cx26等連接蛋白表達明顯下調或缺失，可能與翻譯后Cx的磷酸化有關。當Cx無法聚集在質膜上時，細胞功能性間隙連接結構的形成受阻，導致鼻咽黏膜細胞間失去廣泛通訊，細胞逃避正常的生長調控，最終導致鼻咽癌的發(fā)生。

本研究轉基因組入選小鼠為本課題組前期制備的TgN(p53mt-LMP1)/HT模型鼠，其具有明確的鼻咽上皮細胞轉化特征，系鼻咽癌癌前病變小鼠模型，本研究結果顯示，轉基因組各月齡小鼠鼻咽黏膜上皮中Cx43、Cx32、Cx26 mRNA及其蛋白相對表達量均低于野生組，且轉基因組15、18月齡小鼠目標蛋白及基因表達量低于12月齡小鼠。這表明鼻咽癌癌前病變小鼠的鼻咽黏膜上皮中Cx43、Cx32、Cx26 mRNA轉錄活性降低，相應蛋白表達下調，且隨著月齡增長，可能呈現(xiàn)下降趨勢。上述變化使間隙連接通道不能完成正常組裝，使GJIC功能缺陷，細胞增殖、凋亡調控信號的傳遞失控，在導致細胞過度增殖與異常分化的同時，細胞凋亡受到抑制而形成鼻咽癌癌前病變，并可能進一步發(fā)展為浸潤癌。

結合上述結果，我們認為，Cx基因及蛋白表達下調、GJIC功能缺陷可能與鼻咽黏膜上皮癌前病變的發(fā)生有關，但具體機制仍需進一步研究。

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(收稿日期：2014-10-19)

基金項目：湖南省教育廳科學研究項目(12C1216)。

中圖分類號：R739.63

文獻標志碼：A

文章編號：1002-266X(2015)02-0029-03

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2015.02.010