孔維信,鄧振興，張林，孫懷鑫，丁露露(上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院蘇州九龍醫(yī)院，江蘇蘇州50；山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院附屬醫(yī)院)

·基礎(chǔ)研究·

小鼠足細(xì)胞Tbxa2r基因敲低方法探討

孔維信1,鄧振興2，張林1，孫懷鑫1，丁露露1(1上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院蘇州九龍醫(yī)院，江蘇蘇州21502；2山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院附屬醫(yī)院)

摘要：目的設(shè)計并篩選對足細(xì)胞血栓素A2受體(Tbxa2r)基因表達(dá)敲低效果最佳的siRNA序列。方法培養(yǎng)永生性小鼠足細(xì)胞(MPC5)，取生長占培養(yǎng)板70%細(xì)胞用于實驗。設(shè)計4條siRNA序列(Tbxa2r-mus-1150、Tbxa2r-mus-1309、Tbxa2r-mus-1677、Tbxa2r-mus-1884)，經(jīng)轉(zhuǎn)染效率驗證后轉(zhuǎn)染足細(xì)胞。將細(xì)胞分為四組：干擾組(以篩選出的干擾序列轉(zhuǎn)染細(xì)胞)、空白組(正常細(xì)胞樣品)、模擬組(只加轉(zhuǎn)染試劑的細(xì)胞樣品)、陰性對照組(轉(zhuǎn)染無序干擾系列的細(xì)胞樣品)。Real-time PCR檢測各組細(xì)胞Tbxa2r基因，Western blot法檢測Tbxa2r蛋白。結(jié)果篩選出干擾效果最強(qiáng)的siRNA序列Tbxa2r-mus-1677，其轉(zhuǎn)染24 h后對Tbxa2r基因表達(dá)干擾效果較小，而在轉(zhuǎn)染48 h后足細(xì)胞Tbxa2r基因相對表達(dá)量最低。轉(zhuǎn)染72 h后，細(xì)胞Tbxa2r蛋白相對表達(dá)量明顯降低。結(jié)論采用Tbxa2r特異性siRNA技術(shù)成功敲低足細(xì)胞Tbxa2r基因表達(dá)，并篩選出敲低效果最佳的siRNA序列。

關(guān)鍵詞：足細(xì)胞；血栓素A2受體基因；小分子RNA干擾技術(shù)；基因敲低

血栓素A2(TXA2)是花生四烯酸代謝過程中生成的產(chǎn)物。TXA2及血栓素受體激活參與血管緊張素Ⅱ依賴性高血壓、糖尿病腎病的發(fā)生發(fā)展[1]。有研究表明，血栓素合成酶抑制劑或血栓素受體拮抗劑對鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的腎損傷、狼瘡性腎炎、環(huán)孢素腎毒性、殘余腎及腎移植物排異反應(yīng)均有療效，但作用機(jī)制尚不明確[2]。2011年7月～2012年12月，我們設(shè)計了不同小干擾RNA(siRNA)序列，將小鼠足細(xì)胞TXA2受體(Tbxa2r)基因敲除或敲低，并對siRNA序列進(jìn)行篩選，為進(jìn)一步研究血栓素合成酶抑制劑或血栓素受體拮抗劑的作用機(jī)制奠定理論基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1主要試劑RPMI1640培養(yǎng)基、10%胎牛血清、Trizol、重組干擾素-γ(IFN-γ)購自美國Sigma公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、Taq DNA聚合酶、轉(zhuǎn)染試劑Metafectene購自德國Biontex公司；兔抗小鼠Tbxa2r多克隆抗體、FITC標(biāo)記的羊抗兔IgG、TRITC標(biāo)記的羊抗兔IgG購自美國KPL公司；小鼠抗大鼠GAPDH多克隆抗體、HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG、兔抗羊IgG、羊抗小鼠IgG購自上海華美生物工程公司。

1.2小鼠足細(xì)胞培養(yǎng)條件永生性小鼠足細(xì)胞(MPC5)由Peter Mundel教授(美國Mount Sinia醫(yī)學(xué)院)饋贈。培養(yǎng)條件參照文獻(xiàn)[3]。取生長占培養(yǎng)板70%的細(xì)胞用于實驗。

1.3siRNA序列設(shè)計目標(biāo)基因Tbxa2r基因序列從mRNA的AUG起始密碼開始，尋找“AA”二連序列，并記下其3′端的19個堿基序列，作為潛在的siRNA 靶點。根據(jù)相關(guān)研究結(jié)果[4]，用Genepharma Desiger 2.0軟件輔助設(shè)計4條GC含量在30%～50%的siRNA序列，見表1。

表1　潛在靶點的siRNA序列設(shè)計

1.4細(xì)胞轉(zhuǎn)染與分組由于無法判斷足細(xì)胞是否能進(jìn)行脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染，在實驗前先進(jìn)行轉(zhuǎn)染效率評價：將熒光素Fam標(biāo)記的siRNA以一定比例與陽離子脂質(zhì)體Lipo2000分別按10 pmol/0.25 μL、10 pmol/0.5 μL、20 pmol/0.5 μL混合，混合物按脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染說明書進(jìn)行實驗，通過熒光顯微鏡觀察siRNA進(jìn)入細(xì)胞的數(shù)量及細(xì)胞生長狀態(tài)。選擇最合適的siRNA與脂質(zhì)體混合比例，參照文獻(xiàn)[5]。將細(xì)胞分為四組：干擾組(以篩選出的干擾序列轉(zhuǎn)染細(xì)胞)、空白組(正常細(xì)胞樣品)、模擬組(只加轉(zhuǎn)染試劑的細(xì)胞樣品)、陰性對照組(轉(zhuǎn)染無序干擾系列的細(xì)胞樣品)。

1.5Tbxa2r基因及蛋白檢測

1.5.1Tbxa2r基因檢測Trizol試劑盒提取細(xì)胞總RNA，計算RNA濃度。瓊脂糖電泳檢查RNA的完整性。分別于轉(zhuǎn)染后24、48 h采用Real-time PCR法檢測Tbxa2r基因表達(dá)。以GAPDH和PPIA為內(nèi)參。Tbxa2r mRNA上游引物序列為5′-GACTAAGGACGGAGCTACGACA-3′，下游引物序列為5′-TGAGCCTGGAGGAATGTGAA-3′，反應(yīng)產(chǎn)物249 bp；GAPDH基因上游引物序列為5′-AGGTCGGTGTGAACGGATTTG-3′，下游引物序列為5′-TGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA-3′，反應(yīng)產(chǎn)物123 bp。PPIA上游引物序列為5′-CAAATGCTGGACCAAACACAA-3′，下游引物序列為5′-GCCATCCAGCCATTCAGTCT-3′，反應(yīng)產(chǎn)物71 bp。PCR反應(yīng)體系：2× RT-PCR混合物10 μL，20 μmol/L上、下游引物各 0.1 μL，cDNA模板2 μL，5 U/μL r Taq DNA聚合酶 0.4 μL，雙蒸水定容至20 μL。反應(yīng)條件：95 ℃ 3 min,95 ℃ 30 s，62 ℃ 40 s，共40個循環(huán)。溶解曲線檢測PCR引物的特異性，繪制熒光定量曲線。熒光曲線的起峰位置(即Ct值)初步判斷核酸濃度，核酸濃度越高，起峰位置越早，Ct值越低。利用模板Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)呈對數(shù)線性關(guān)系，計算目標(biāo)基因與內(nèi)參基因的相對含量。

1.5.2Tbxa2r蛋白檢測分別于轉(zhuǎn)染后48、72 h采用Western blot法檢測Tbxa2r蛋白相對表達(dá)量，操作步驟參照文獻(xiàn)[5, 6]。

2結(jié)果

2.1細(xì)胞轉(zhuǎn)染情況熒光顯微鏡觀察結(jié)果顯示，當(dāng)用0.5 μL Lipo2000與10 pmol siRNA、0.5 μL Lipo2000與20 pmol siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞時，足細(xì)胞出現(xiàn)皺縮或脫落，對細(xì)胞生長影響較大；而0.25 μL Lipo2000與10 pmol siRNA的轉(zhuǎn)染效率為70%，此時細(xì)胞狀態(tài)和正常足細(xì)胞基本一致，故選擇該比例進(jìn)行轉(zhuǎn)染。

2.2Tbxa2r基因表達(dá)Tbxa2r引物擴(kuò)增產(chǎn)物溶解溫度為86～88 ℃，PPIA引物擴(kuò)增產(chǎn)物為82～86 ℃，GAPDH引物擴(kuò)增產(chǎn)物為86～88 ℃，證明所用PCR引物特異性良好，擴(kuò)增的產(chǎn)物為目標(biāo)基因。由熒光定量曲線可知，樣品中Tbxa2r基因含量極低，熒光曲線起峰位置在32個PCR循環(huán)左右，而內(nèi)參基因PPIA和GAPDH的起峰位置均在16個循環(huán)左右。各干擾序列在轉(zhuǎn)染后24 h對目標(biāo)基因表達(dá)幾乎沒有干擾效果。而在轉(zhuǎn)染后48 h時，第3條和第4條干擾序列轉(zhuǎn)染的細(xì)胞熒光曲線起峰位置向后推遲了兩個循環(huán)(說明存在一定干擾效果)。經(jīng)計算，引物Tbxa2r-mus-1677干擾48 h后Tbxa2r基因相對表達(dá)量最低，為0.18，初步判定這條干擾序列作用效果最好。干擾系列對內(nèi)參基因的含量影響不大。見表2。

表2　各組細(xì)胞Tbxa2r基因相對表達(dá)量

2.3Tbxa2r蛋白表達(dá)轉(zhuǎn)染后48 h，Tbxa2r蛋白表達(dá)豐度不高，但可以看出條帶，而在轉(zhuǎn)染后72 h，Tbxa2r蛋白表達(dá)量明顯降低。各組Tbxa2r蛋白相對表達(dá)量結(jié)果見表3。Real-time PCR結(jié)果與Western blot結(jié)果共同表明，Tbxa2r-mus-1677在轉(zhuǎn)染48 h時從mRNA水平下調(diào)足細(xì)胞Tbxa2r表達(dá)，在轉(zhuǎn)染72 h時，從蛋白水平下調(diào)Tbxa2r表達(dá)。

表3　各組細(xì)胞Tbxa2r蛋白相對表達(dá)量

3討論

RNA干擾技術(shù)是通過siRNA造成目的mRNA特異性降解，從而使基因轉(zhuǎn)錄后沉默的一種現(xiàn)象。這一現(xiàn)象廣泛存在于自然界，是生物進(jìn)化過程中抵御外來基因侵害的一種機(jī)制，為穩(wěn)定基因組發(fā)揮重要作用。RNA干擾是一種簡單、有效的代替基因剔除的遺傳工具，廣泛用于功能基因組學(xué)研究領(lǐng)域。研究表明，環(huán)氧合酶-2(COX-2)的表達(dá)與足細(xì)胞凋亡相關(guān)。Cheng等[7]認(rèn)為足細(xì)胞COX-2過度表達(dá)可使細(xì)胞更易受到損傷。我們前期研究發(fā)現(xiàn)嘌呤霉素氨基核苷(PAN)可誘導(dǎo)足細(xì)胞凋亡，COX-2表達(dá)增加；進(jìn)一步將足細(xì)胞COX-2基因敲除或敲低，發(fā)現(xiàn)經(jīng)PAN誘導(dǎo)發(fā)生的足細(xì)胞凋亡較未敲低者明顯減輕[8～10]。COX-2基因敲低、表達(dá)減少或COX-2活性抑制，可導(dǎo)致下游的一種前列腺素物質(zhì)即TXA2產(chǎn)生減少[11～18]，使后者對足細(xì)胞的損傷減輕。TXA2通過與其受體Tbxa2r結(jié)合發(fā)揮作用。Tbxa2r廣泛分布于不同組織器官的細(xì)胞膜及細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)上，由7個跨膜區(qū)、3個細(xì)胞外袢和3個細(xì)胞內(nèi)袢組成。Tbxa2r與TXA2結(jié)合后，可引起與受體偶聯(lián)的G蛋白發(fā)生變構(gòu)，激活細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)，調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝，引起血小板聚集和血管平滑肌收縮，進(jìn)一步參與血管緊張素Ⅱ依賴性高血壓、糖尿病腎病的發(fā)生發(fā)展[1]。

本課題組在前期實驗的基礎(chǔ)上進(jìn)行了Tbxa2r siRNA實驗，將足細(xì)胞Tbxa2r基因敲除或敲低。由于TXA2有很強(qiáng)的生理活性，如將Tbxa2r基因敲除則可能干擾足細(xì)胞的正常功能，因此我們選擇足細(xì)胞Tbxa2r基因敲低，維持其基礎(chǔ)的基因表達(dá)。我們采用siRNA技術(shù)，首先根據(jù)轉(zhuǎn)染效率篩選出最合適的脂質(zhì)體與siRNA反應(yīng)比例(0.25 μL Lipo2000與10 pmol siRNA)，照此比例將合成的4條siRNA轉(zhuǎn)染小鼠足細(xì)胞。PCR熒光定量曲線結(jié)果顯示，第三條siRNA序列(Tbxa2r-mus-1677)在轉(zhuǎn)染后48 h對Tbxa2r基因的敲低效果最好。將此干擾序列轉(zhuǎn)染細(xì)胞，得到實驗所需的干擾組，再與空白組(正常細(xì)胞樣品)、模擬組(只加轉(zhuǎn)染試劑的細(xì)胞樣品)、陰性對照組(轉(zhuǎn)染無序干擾系列的細(xì)胞樣品)比較發(fā)現(xiàn)，Tbxa2r-mus-1677干擾48 h后Tbxa2r基因相對表達(dá)量最低(為0.18)；轉(zhuǎn)染48、72 h后，Tbxa2r蛋白表達(dá)豐度不高，而在轉(zhuǎn)染后72 h表達(dá)明顯降低。以上結(jié)果表明，Tbxa2r-mus-1677相應(yīng)的siRNA序列對小鼠足細(xì)胞中的Tbxa2r有最好的敲低效果，其在轉(zhuǎn)染后48 h時下調(diào)Tbxa2r基因表達(dá)，轉(zhuǎn)染后72 h下調(diào)Tbxa2r蛋白表達(dá)。

本研究采用Tbxa2r特異性siRNA技術(shù)，成功敲低小鼠足細(xì)胞中Tbxa2r基因表達(dá)，并篩選出敲低效果最強(qiáng)的siRNA序列，為特異性Tbxa2r拮抗劑干預(yù)足細(xì)胞凋亡相關(guān)的實驗研究奠定了基礎(chǔ)。

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(收稿日期：2014-07-22)

通信作者：鄧振興

基金項目：蘇州市科技計劃項目(SYSD2011070)。

中圖分類號：R329.2

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1002-266X(2015)02-0024-03

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2015.02.008