韓瑞芳，曹艷萍，王若珩，張凌燕

(1.西北政法大學(xué)公安學(xué)院,陜西西安710063)

(2.西南政法大學(xué)刑事偵查學(xué)院,重慶401120)

0 引言

殼聚糖是天然生物高分子甲殼素的衍生物，具有無(wú)毒且可以成膜等許多優(yōu)良性質(zhì)，而該分子中含有豐富的氨基，其與納米金之間有很強(qiáng)的親和力，故被廣泛用于傳感器中制備電極[1]。

亞硝酸鹽是肉制品及其它食品加工過(guò)程中常用的一種食品添加劑。此外，在泡菜及不新鮮的食物中也容易出現(xiàn)亞硝酸鹽。食品中亞硝酸鹽含量超過(guò)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，就會(huì)導(dǎo)致食物中毒。由于亞硝酸對(duì)人體的危害，其檢測(cè)受到全世界的重視。近些年來(lái)，國(guó)內(nèi)外研究工作者利用電流型傳感器對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)的報(bào)道明顯增多。國(guó)外主要選用特異性亞硝酸鹽還原酶，Silveira.C.M 小組[2]為其代表，他們選用多媒體細(xì)胞色素c 和亞硝酸還原酶[3-6]，Almeida.M.G 小組、Davis.J.J 小組等[7-8]用含銅型亞硝酸鹽還原酶，C.C.Rosa 小組[9]則用細(xì)胞色素cd1 亞硝酸鹽還原酶[10-11]作為亞硝酸鹽特異性識(shí)別元素。國(guó)內(nèi)的研究則主要集中在用非特異性蛋白如血紅蛋白[12]、肌紅蛋白[13-14]或細(xì)胞色素c[15]作為生物識(shí)別元素檢測(cè)亞硝酸鹽，而西南大學(xué)的袁若小組[16]則利用鑭–多壁納米碳管等具有催化性能的納米材料作為識(shí)別元素檢測(cè)亞硝酸鹽，該傳感器由于無(wú)酶或蛋白質(zhì)，傳感器穩(wěn)定性顯著提高。

該文采用帶豐富氨基的殼聚糖(CS)分散納米碳(Nano-C)后將其滴加于電極上，利用其氨基吸附納米金(Nano-Au)，從而制備了無(wú)生物物質(zhì)標(biāo)記且無(wú)電子媒介體的亞硝酸鹽傳感器：(1)該傳感器制備及反應(yīng)過(guò)程中無(wú)電子媒介體，故無(wú)電子媒介體滲漏、富集等不良問(wèn)題，進(jìn)一步提高了電極穩(wěn)定性；(2) 該傳感器在反應(yīng)過(guò)程中無(wú)生物物質(zhì)，顯著提高了電極的使用壽命；(3) 該傳感器制備簡(jiǎn)單，成本低廉。

圖1 電極修飾過(guò)程表征圖：(a)裸金電極；(b)CS@Nano-C 修飾的金電極；(c)Nano-Au/CS@Nano-C 修飾的金電極，測(cè)試底液0.25 mol/L PBS(pH6.0)+25 μmol/L NO2-Fig.1 CV at a:(a)Au electrode,(b)CS@Nano-C modified Au electrode,(c)Nano-Au/CS@Nano-C modified Au electrode in PBS and NO2-

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

殼聚糖、氯金酸(Sigma 公司)，納米碳(北京德科島金科技有限公司)；檸檬酸三鈉(四川化學(xué)試劑廠)。實(shí)驗(yàn)用水為二次蒸餾水。

CHI660A型電化學(xué)工作站(上海辰華儀器公司) 三電極系統(tǒng)：Nano-Au/復(fù)合殼聚糖@ 納米碳（Nano-Au/CS@ Nano-C） 修飾金電極為工作電極，飽和甘汞電極為參比電極，鉑絲電極為對(duì)電極，0.25 mol/L PBS溶液(pH6.0)為測(cè)試底液。

1.2 免疫傳感器的制備

取1 mg 殼聚糖和1 mL mol/L 醋酸溶液混合，對(duì)其超聲2 h 后，然后取1mg 納米碳加入4 mL 上述殼聚糖溶液中，超聲分散4 h 后得到均勻分散的黑色懸濁液。在已預(yù)處理的金電極(Φ=4.0 mm)表面滴加8 μL CS@Nano-C，在室溫條件下讓其自然干燥，待完全風(fēng)干后置入Nano-Au(4℃，8 h) 制的Nano-Au/CS@Nano-C 修飾電極，水洗后置于4℃冰箱中保存待用。

2 結(jié)果與討論

2.1 電極自組裝過(guò)程的電化學(xué)表征

以不同修飾狀態(tài)的電極為工作電極，于0.25 mol/L PBS(pH6.0)測(cè)試底液中含25 μmol/L NO2-在0.2～1.2V 范圍內(nèi)進(jìn)行循環(huán)伏安測(cè)定，所得循環(huán)伏安曲線如圖1所示。圖1a 是裸金電極的循環(huán)伏安曲線圖，圖1b 是CS@Nano-C 修飾金電極的循環(huán)伏安，由于Nano-C 催化性能，電極峰電流明顯增大。當(dāng)CS@Nano-C 修飾電極吸附Nano-Au后，由于納米金具有良好的導(dǎo)電性，能促進(jìn)電子的傳遞，故峰電流值繼續(xù)增大(圖1c)。

2.2 NO2-在Nano-Au/CS@Nano-C 修飾電極上的電化學(xué)行為

圖2考查了Nano-Au/CS@ Nano-C 修飾電極對(duì)NO2-的電催化還原能力。當(dāng)NO2-濃度分別是0 mol/L，0.9×10-4mol/L，4.0×10-4mol/L時(shí)，從圖2a到圖2c，可看出Nano-Au/CS@Nano-C 電極的氧化峰電流顯著增加，這證明Nano-Au/CS@Nano-C 對(duì)NO2-有良好的電化學(xué)行為。

圖2 Nano-Au/CS@Nano-C 修飾電極在0.25 mol/L PBS(pH6.0)中含不同NO2-的CV 響應(yīng)：(a)0 mol/L，(b)0.9×10-4 mol/L，(c)4.0×10-4 mol/LFig.2 CV response of Nano-Au/CS@Nano-C modified Au electrode in PBS at various NO2-concentrations:(a)0 mol/L,(b)0.9×10-4 mol/L,(c)4.0×10-4 mol/L

2.3 實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化

圖3比較了CS@ Nano-C 與Nano-Au/CS@Nano-C 不同修飾電極對(duì)NO2-響應(yīng)的影響。由圖可見(jiàn)，與CS@Nano-C 修飾電極相比，Nano-Au/CS@ Nano-C 電極對(duì)NO2-響應(yīng)最好，故選擇Nano-Au/CS@Nano-C 電極為工作電極。

圖3 不同修飾電極在0.25 mol/L PBS(pH6.0)中對(duì)NO2-的電流響應(yīng)：(a)CS@Nano-C 修飾電極；(b)Nano-Au/CS@Nano-C 修飾電極Fig.3 Current response of different electrode in PBS:(a)CS@Nano-C modified Au electrode,(b)Nano-Au/CS@Nano-C modified Au electrode

實(shí)驗(yàn)比較了滴加Nano-C 量對(duì)電極的影響，發(fā)現(xiàn)若Nano-C 量過(guò)多時(shí)與電極結(jié)合不牢，Nano-C 膜易脫落，而當(dāng)Nano-C 量過(guò)少，工作電極靈敏度降低。此外，用于分散Nano-C時(shí)CS 的濃度也會(huì)對(duì)電極帶來(lái)很大影響，當(dāng)加入Nano-C 中CS 的濃度過(guò)大時(shí)，將嚴(yán)重阻礙電子傳遞，降低響應(yīng)；而當(dāng)加入Nano-C 中CS 的濃度較少時(shí)，又不利于CS@Nano-C 膜的穩(wěn)定。因此，實(shí)驗(yàn)中Nano-C 在CS 中的含量為0.25 mg/L。

pH 對(duì)Nano-Au/CS@Nano-C 電極催化反應(yīng)及其活性有重要影響。該次實(shí)驗(yàn)在酸性及中性環(huán)境內(nèi)檢測(cè)了Nano-Au/CS@ Nano-C 電極的電流響應(yīng)，由圖4可知,當(dāng)pH為6.0時(shí)，該修飾電極對(duì)NO2-催化效果最佳；當(dāng)pH為4.0時(shí)，該修飾電極對(duì)NO2-催化效果最差。其可能的原因是CS 在酸性條件下不穩(wěn)定，易溶于水，而當(dāng)電極置于中性環(huán)境內(nèi)時(shí)，電極反應(yīng)缺少相應(yīng)的質(zhì)子，故電催化變困難，電極的電流響應(yīng)降低。

圖4 Nano-Au/CS@Nano-C 修飾電極在不同pH 測(cè)試底液中對(duì)NO2-的電流響應(yīng)Fig.4 Current response of Nano-Au/CS@Nano-C electrode in different pH

Nano-Au/CS@ Nano-C 修飾電極對(duì)NO2-有良好催化性能，在優(yōu)化條件下，其在NO2-濃度為8.0×10-6～2.0×10-4mol/L 范圍內(nèi)有線性響應(yīng)(圖5)，線性方程y =0.1146x + 0.409，檢測(cè)下線2.7×10-6mol/L(S/N=3)，這是因?yàn)榧{米碳有較好的催化性能，而Nano-Au 能促進(jìn)電子傳遞，二者協(xié)同作用，故電極靈敏度提高。

圖5 Nano-Au/CS@Nano-C 修飾電極在0.25 mol/L PBS(pH6.0)中的動(dòng)力學(xué)響應(yīng)曲線Fig.5 Current response response of Nano-Au/CS@Nano-C modified Au electrode in PBS at various NO2-concentrations

2.4 電極的穩(wěn)定性、重現(xiàn)性、干擾實(shí)驗(yàn)

為了考察該修飾電極的穩(wěn)定性，將Nano-Au/CS@Nano-C 電極置于不含NO2-的測(cè)試底液中連續(xù)循環(huán)掃描100 圈后，其電流響應(yīng)信號(hào)仍能保持初始信號(hào)的97.2%，這證明由于該修飾電極無(wú)電子媒介體，電極穩(wěn)定性顯著提高。此外，殼聚糖的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)將納米碳穩(wěn)固于電極上，其氨基與Nano-Au 強(qiáng)烈的吸附作用又增加了Nano-Au 的穩(wěn)定性。為了考察該修飾電極的壽命，將該電極置于2～8℃冰箱中放置10 d，在放置期間歇性使用，其響應(yīng)信號(hào)稍有變化，但變化量沒(méi)有超過(guò)初始信號(hào)的2.2%。同時(shí)制備4 支電極，分別在NO2-濃度為50 μmol/L NO2-下對(duì)其進(jìn)行測(cè)定，4 支電極其響應(yīng)電流的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD＜4.0%，表明該修飾電極具有良好的重現(xiàn)性。

NO2-在pH6.0 PBS 中，其峰電位在0.8 V，抗壞血酸及多巴胺峰電位分別在0.2 V、1.1 V，而過(guò)氧化氫峰電位在-0.7 V。因此，上述常見(jiàn)物質(zhì)均不會(huì)對(duì)NO2-的檢測(cè)產(chǎn)生干擾。

2.5 回收測(cè)定

以0.25 mol/L PBS(pH6.0)為測(cè)試底液，把標(biāo)準(zhǔn)NO2-配制成不同濃度的待測(cè)品，將該工作電極置于待測(cè)樣品溶液中各測(cè)定3次，測(cè)定其電流響應(yīng)變化值，結(jié)果列于表1，該工作電極的回收率從98.0%～103.5%。

表1 該電極的回收結(jié)果(n=3)Tab.1 Recovery of the prepared biosensor(n=3)

3 結(jié)論

該文以殼聚糖分散的納米碳為基底結(jié)合納米金，利用Nano-Au/CS@Nano-C 的直接電催化作用制備了具有催化性能的納米材料作為識(shí)別元素檢測(cè)亞硝酸鹽的傳感器。該傳感器具有制備簡(jiǎn)單、靈敏度高、穩(wěn)定性好、無(wú)外加毒性物質(zhì)，且無(wú)電子媒介體滲漏、富集等消極問(wèn)題。

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