朱 強,余紅霞

（1.重慶師范大學化學學院綠色合成與應用重點實驗室，重慶401331 ）

（2.西南大學化學化工學院，重慶400715）

0 引言

甲胎蛋白 (AFP)是一種重要的腫瘤標志物，其分子量約為70 KD，在正常人體內(nèi)腦脊液中水平是20 ng/mL，血清中的水平是5～10 ng/mL[1]。AFP 的測定對臨床醫(yī)學來說有著極為重要的意義[2-3]。

生物傳感器制作中最重要一點是生物分子的固化。金的納米復合材料能夠吸附許多生物分子和維護生物分子的生物活性[4-6]，最近，金-石墨烯（Au-Gra）被寄予很大的關(guān)注，它的機械性能好，比表面積大，具有優(yōu)良的電子傳速速率[7-9]。在此，通過在電極表面依次沉積金，結(jié)合NiNPs,Au-Gra 和抗AFP，構(gòu)建了一種直接法檢測甲胎蛋白的免疫傳感器。該免疫傳感器靈敏度高，檢測快速，抗干擾性能好，可望用于臨床診斷。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

CHI660D型電化學工作站（上海辰華儀器公司），BRANSONIC 200超聲清洗儀 （德國BRANSON ULTRASCHALL 公司），電化學反應池為三電極體系,修飾過的金電極為工作電極，鉑電極為對電極，飽和甘汞電極為參比電極。H600透射電子顯微鏡（日本日立儀器公司）。

AFP、AFP 單克隆抗體(anti-AFP)，牛血清白蛋白(BSA，96%～99%)（鄭州博賽生物試劑公司）；氧化石墨(GO)（南京先鋒納米科技有限公司），氯金酸(HAuCl4)、抗壞血酸 （AA）（Sigma 公司，美國）；鐵氰化鉀，氯化鎳 （四川化學試劑有限公司）。所用的其它試劑都是分析純，整個實驗過程中所用的水都是二次蒸餾水。

1.2 Au-Gra 的制備

Au-Gra 納米復合物按照如下的步驟制得：首先將2 mg GO 超聲溶解在2 mL 水里，加入0.1 g AA 在室溫下磁力攪拌過夜。加入2 mL 1%HAuCl4溶液繼續(xù)攪拌8 h 還原生成Au-Gra 復合物，得到的產(chǎn)物經(jīng)過多次離心清洗，最后分散到1 mL 水中待用。

1.3 免疫傳感器的制備

金電極分別用粒徑為0.3 和0.05 μm 的Al2O3粉拋光，在蒸餾水和乙醇中超聲清洗，室溫下晾干。將電極浸入2 mL 1 % 的HAuCl4溶液中，在-0.2 V 的電壓下沉積30 s。然后在電極表面滴加10 μL 鎳納米粒子（依據(jù)文獻[10]制備）并晾干清洗,再將10 uL 的Au-Gra 滴加在上述電極上,得到的電極在200 ng/mL anti-AFP溶液中孵育12 h(4℃)。然后用0.25%BSA 在37℃下浸泡30 min 以封閉非特異性活性位點。完成的免疫傳感器在4℃的條件下保存（圖1）。

圖1 免疫傳感器的制備過程示意圖Fig.1 Schematic diagram of the construction process of the immunosensor

1.4 實驗的檢測方法

檢測時，將免疫電極浸入待測溶液中孵育15 min（25℃）并清洗以去除去表面多余的物質(zhì)。采用循環(huán)-伏安法檢測孵育前后的電流變化，掃描電極的電位區(qū)間為0 ～0.8 V，掃描速率為100 mV/s。當背景電流穩(wěn)定，反應前陽極上的峰電流為I0。當免疫反應發(fā)生后，峰電流記為I，電流的變化值記為ΔI，則ΔI=I0-I。

2 結(jié)果與討論

2.1 免疫傳感器的循環(huán)伏安特性

在0.1 mol/L PBS溶液中，因為缺乏電子傳遞中間體，裸露的金電極上并沒有氧化還原峰（圖2曲線a）。由于沉積AuNPs 增加了電極的比表面積，背景電流增大（圖2曲線b）。當在AuNPs 修飾的電極上滴加一層NiNPs，一對典型的可逆的氧化還原峰出現(xiàn)（圖2曲線c），表明NiNPs 具有良好的電活性，能有效地促進電子轉(zhuǎn)移。當?shù)渭恿薃u-Gra 后，峰值電流進一步增強 （圖2曲線d），可歸結(jié)于是Au-Gra 具有良好的導電性。當結(jié)合了anti-AFP 和BSA 之后，電流值均有所降低（圖2曲線e 和f）。這是由于anti-AFP 和BSA 都是蛋白質(zhì)大分子，阻礙了電子的傳輸。當傳感器孵育了10 ng/mL 的AFP溶液后，電流值再次減?。▓D2曲線g）。這是因為形成的免疫復合物進一步阻礙了電子的傳輸。

圖2 電極修飾過程的循環(huán)伏安圖：(a) 裸Au 電極，(b)AuNPs 修飾，(c)NiNPs/AuNPs 修飾，(d)Au-Gra/NiNPs/AuNPs 修飾，（e）孵育anti-AFP 后的電極，（f）BSA 封閉后，(g）孵育10 ng/mL AFPFig.2 CVs for(a)bare electrode;(b)AuNPs;(c)NiNPs/AuNPs;(d)Au–Gra/NiNPs/AuNPs;(e) anti-AFP/Au–Gra/NiNPs/AuNPs modified electrode;(f)blocked with 0.25%BSA;(g)after incubation of 10 ng/mL AFP

圖3 免疫電極在不同掃速下在PBS(pH為7.4) 中的循環(huán)伏安圖（從內(nèi)至外）：20、50、80、100、150、250、350、500、600 mV/s。插圖表明氧化還原峰電流與掃速的平方根成正比Fig.3 CVs of the modified electrode at different scan rates （from inner to outer）：20,50,80,100,150,250,350,500,600 mV/s in PBS（pH=7.4）.The inset shows the dependence of redox peak currents on the scan rates

2.2 檢測條件的優(yōu)化

2.2.1 pH 對免疫反應的影響

由于工作溶液的pH值對響應電流有很大的影響，研究了pH值從4.0到9.0 的PBS 對電極響應電流的大小。結(jié)果表明，在pH為7.4時響應電流最大。因此，選用pH值為7.4 的PBS 緩沖溶液作為工作溶液。

2.2.2 溫度對免疫反應的影響

通常溫度在18到45℃之間對免疫傳感器性能的影響最大。實驗表明，在其他條件不變的條件下，在37℃之前提高溫度對免疫反應有促進作用。37℃是此免疫反應的最佳溫度，但考慮到較高的溫度容易使蛋白質(zhì)變性，所以在實驗中選用25℃作為免疫反應的溫度。

2.2.3 孵育時間對免疫反應的影響

對免疫反應的孵育時間也作了研究。結(jié)果顯示，孵育時間在15 min 以前，響應電流隨孵育時間的上升而迅速上升，在15 min 之后響應電流隨孵育時間的上升而趨于平穩(wěn)，則表明在15 min時電極上免疫復合物基本達到飽和。因此，15 min為優(yōu)化的孵育時間。

2.2.4 掃描速度對免疫反應的影響

圖3為免疫電極在不同掃速下的循環(huán)伏安圖。掃描速度從20～600 mV/s 不斷增大，氧化還原峰的電流值也不斷增大且與掃描速度的平方根成正比。表明該反應受擴散控制。

2.3 免疫傳感器的性能

2.3.1 CV 響應的標準曲線

如圖4所示，抗原與抗體反應之后峰電流隨著AFP 的濃度的增加而變小，其原因是免疫復合物的形成阻止了電子遷移到電極表面。當AFP 的濃度在0.1～100 ng/mL時，響應電流的變化值ΔI正比于AFP 濃度的對數(shù)值，且其回歸方程式為ΔI(μA)=103.78+40.54 lg cAFP(ng/mL)。

圖4 AFP 濃度的對數(shù)與陽極峰電流變化的標準曲線Fig.4 The calibration plots of the change of anodic peak current versus the logarithm of the concentrations of AFP

2.3.2 免疫傳感器的選擇性、重現(xiàn)性、穩(wěn)定性

選擇性是免疫傳感器的重要性能。為了評估傳感器的選擇性，在10 ng/mL 的AFP 中分別加入前胃液素釋放肽(ProGRP,50 ng/mL)，癌胚抗原(CEA,50 ng/mL)，BSA(1 mg/mL)。響應電流的變化分別為4.2%，3.1%，2.8%。這表明此傳感器的選擇性是可以接受的。

重現(xiàn)性測試，選擇了5 支電極檢測10 ng/mL的AFP。這5 支免疫傳感器的響應電流的變化值標準偏差為3.2%(n=5),具有較好的重現(xiàn)性。

孵育了10 ng/mL AFP 的電極在PBS 中用CV 掃描100 圈后其陰極峰電流的變化值小于3.47%，表明該免疫傳感器具有良好的穩(wěn)定性。

3 結(jié)論

通過在金電極上沉積AuNPs，修飾具有良好的電活性、能有效地促進電子轉(zhuǎn)移的NiNPs，并結(jié)合有良好的導電性的Au-Gra 復合膜，最后利用Au-Gra 來結(jié)合anti-AFP,可以制得簡單、靈敏AFP 免疫傳感器，該免疫傳感器具有較寬的線性范圍和較低的檢測限。良好的選擇性、穩(wěn)定性、重現(xiàn)性，可望用于臨床醫(yī)學中。

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