靳雙星，張桂枝，雷蘭霞

（1.河南牧業(yè)經(jīng)濟學院畜牧工程系，河南 鄭州450046 ；2.河南?？h職業(yè)中等專業(yè)學校，河南 鶴壁456250）

發(fā)酵是中藥炮制的一種重要手段和方法。微生物可利用中藥成分作為營養(yǎng)物質(zhì)進行生長、繁殖和代謝，在此過程中分泌的蛋白酶、纖維素酶、半纖維素酶等胞外酶，使植物細胞壁破裂，從而利于中藥有效成分從胞內(nèi)釋放，最大限度地得以提取和利用[1]。多位研究者[2-4]對中藥生物發(fā)酵進行了研究，取得了一定的進展。但多針對單一菌種與單一中藥的發(fā)酵研究，缺乏復方中藥制劑與復合菌種聯(lián)合發(fā)酵的研究，因此，本試驗利用多種菌種混合固態(tài)發(fā)酵加減四君子湯，考察其對加減四君子湯成分變化及多糖提取的影響，對復方中藥發(fā)酵制劑質(zhì)量評價有一定的參考意義，為該制劑工業(yè)化應用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌種 枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、產(chǎn)朊假絲酵母（Candida utilis）、嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus），購自中國普通微生物菌種保藏中心。

1.2 加減四君子湯 由連翹、黃芪、板藍根、茯苓、白術、枳實、山楂、甘草等8 味中藥組成。購自鄭州九九重陽大藥房。分別于50 ℃～60 ℃下烘干2～3 h，粉碎，100%過80 目篩，備用。

1.3 培養(yǎng)基 種子培養(yǎng)基：枯草芽孢桿菌采用營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，在37 ℃、200 r/min 條件下培養(yǎng)16～17 h 后,調(diào)整活菌數(shù)達到1×109CFU/mL；產(chǎn)朊假絲酵母采用YPD 培養(yǎng)基，在28 ℃、200 r/min 條件下培養(yǎng)20～24 h 后，調(diào)整活菌數(shù)達到1×109CFU/mL。嗜酸乳桿菌采用MRS 培養(yǎng)基，在37 ℃、200 r/min 條件下培養(yǎng)16～17 h 后，調(diào)整活菌數(shù)達到1×109CFU/mL。

1.4 固態(tài)培養(yǎng)基 以加減四君子湯為主要發(fā)酵原料，含麩皮3.0%、葡萄糖2.5%、硫酸銨1.5%、磷酸二氫鉀0.15%、磷酸氫二鉀0.5%、MgS04.7H2O O.5%。此培養(yǎng)基在121 ℃下滅菌20 min，備用。1.5 加減四君子湯發(fā)酵制劑的制備 加減四君子湯發(fā)酵前調(diào)整物料含水量為50%，pH 值為6.0左右，使枯草芽孢桿菌：產(chǎn)朊假絲酵母：嗜酸乳桿菌=1∶1∶1，混勻后，按4%接種量接入物料中，攪拌均勻后裝入不透氣的塑料袋中，壓實，封口，置于31 ℃的環(huán)境中培養(yǎng)72 h，烘干，備用。

1.6 發(fā)酵前后加減四君子湯成分測定方法 為減少誤差，對發(fā)酵前加減四君子湯成分測定時，也要以同樣條件制備固體培養(yǎng)基、調(diào)整物料含水量、pH 值以及混菌接種，不經(jīng)發(fā)酵，烘干，備用，暫稱為發(fā)酵前混菌加減四君子湯。粗蛋白測定采用凱氏定氮法；粗脂肪測定采用索氏提取法；中性洗滌纖維、酸性洗滌纖維、木質(zhì)素測定采用Van Soest 法測定。

1.7 多糖的提取 稱取發(fā)酵前混菌加減四君子湯和加減四君子湯發(fā)酵制劑各100 g，加蒸餾水1 000 mL，在80 ℃水浴浸提2 h，提取3 次，合并水提液，離心，上清液濃縮至100 mL，加95%乙醇至含醇量為80%，靜置12 h，減壓抽濾，上清液加95%乙醇至含醇量為80%，靜置12 h，減壓抽濾，分離出沉淀用無水乙醇洗滌多次，低溫干燥，即得相應多糖粗提物。重復3 次，計算得率。

1.8 多糖的含量測定 參照文獻[5]介紹的蒽酮-濃硫酸法測定多糖含量。

1.9 數(shù)據(jù)處理試驗數(shù)據(jù)使用Excel 2007 和SPSS 12.0 統(tǒng)計軟件進行處理與分析。

2 結果與分析

2.1 混菌發(fā)酵前后加減四君子湯營養(yǎng)成分變化

從表1 的試驗結果可以看出，加減四君子湯經(jīng)混菌發(fā)酵后，粗蛋白由發(fā)酵前的10.75%提高到15.16%，提高了41.02%，與發(fā)酵前相比具有顯著差異（P＜0.05）；粗脂肪由發(fā)酵前的2.37%提高到3.63%，提高了53.16%，與發(fā)酵前相比具有顯著差異（P＜0.05）；中性洗滌纖維由發(fā)酵前的46.72%降低到33.68%，降低了27.91%，與發(fā)酵前相比具有顯著差異（P＜0.05）；酸性洗滌纖維、木質(zhì)素分別降解了21.46%、12.27%，但與發(fā)酵前相比差異不顯著（P＞0.05）。發(fā)酵后粗蛋白、粗脂肪含量明顯升高，而中性洗滌纖維、酸性洗滌纖維和木質(zhì)素都有不同層度降解，說明加減四君子湯混菌發(fā)酵前后營養(yǎng)價值有了明顯的提高。

2.2 混菌發(fā)酵前后加減四君子湯多糖得率和含量變化 由表2 試驗結果可知，加減四君子湯經(jīng)混菌發(fā)酵后，多糖得率由發(fā)酵前的15.41%提高到21.84%，提高了41.73%，與發(fā)酵前相比具有極顯著差異（P＜0.01）；多糖含量由發(fā)酵前的45.66%提高到56.75%，提高了24.29%，與發(fā)酵前相比具有極顯著差異（P＜0.01）。

表2 混菌發(fā)酵前后加減四君子湯多糖得率和含量變化（%，n=3）

3 討論

目前使用的中藥多為植物體或植物的部分組織，其有效成分多存在于植物細胞內(nèi)，然而植物細胞有細胞壁保護，細胞壁又是由纖維素、半纖維素、木質(zhì)素等組成，因其結構致密，胞內(nèi)大分子活性物質(zhì)難以穿過細胞壁，導致中藥的有效成分利用率較低[6-7]。為提高復方中藥制劑的利用效率，本研究利用優(yōu)選的多菌種發(fā)酵工藝，對加減四君子湯進行混菌發(fā)酵處理，發(fā)酵后，其營養(yǎng)價值有了明顯的提高，粗多糖的得率和含量有明顯的提升。這可能是由于以下幾個方面的原因：微生物利用中藥成分作為營養(yǎng)基質(zhì)進行生長、繁殖和代謝，產(chǎn)生了大量的菌體蛋白、脂類或胞外多糖；在發(fā)酵過程中細菌分泌了大量的纖維素酶、半纖維素酶等胞外酶，使植物細胞壁破裂，從而利于中藥有效成分從胞內(nèi)釋放，最大限度地得以提取和利用；也有可能在混菌發(fā)酵過程中，產(chǎn)生的大量有機酸，細胞壁纖維起到軟化或分解作用，導致大量加減四君子湯中的多糖從細胞中游離出，從而提高了粗多糖的得率和含量。

4 結論

加減四君子湯經(jīng)混菌發(fā)酵后可顯著提高其營養(yǎng)價值和粗多糖的得率與含量。

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