李文婷，閆恕，張丹丹，賈博巖，唐艷，孔令聰，

裴志花1，劉樹明1，馬紅霞1,2*

?

一種新型家蠅幼蟲抗菌肽基因(MDAP-2)的真核表達(dá)及抑菌活性檢測(cè)

李文婷1，閆恕1，張丹丹1，賈博巖1，唐艷1，孔令聰1，

裴志花1，劉樹明1，馬紅霞1,2*

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué),動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長(zhǎng)春 130118；2.動(dòng)物生產(chǎn)及產(chǎn)品質(zhì)量安全教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)，長(zhǎng)春 130118)

利用畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)新型家蠅抗菌肽MDAP-2基因(Muscadomesticaantimicrobial peptide,MDAP-2)，為其作為新型抗菌物質(zhì)應(yīng)用于臨床提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。根據(jù)已有的MDAP-2的氨基酸序列，采用PCR技術(shù)擴(kuò)增獲得MDAP-2基因，構(gòu)建真核重組表達(dá)質(zhì)粒pPIC9K-MDAP-2，將線性化的重組質(zhì)粒電擊轉(zhuǎn)入畢赤酵母(P.pastoris)感受態(tài)GS115細(xì)胞內(nèi)，將PCR鑒定為陽(yáng)性的重組酵母菌進(jìn)行甲醇誘導(dǎo)表達(dá)，并采用Tricine-SDS-PGAE檢測(cè)表達(dá)產(chǎn)物的大小，經(jīng)鎳柱親和層析純化獲得純度較高的重組蛋白，采用管碟法檢測(cè)重組蛋白的生物學(xué)活性。結(jié)果顯示，重組質(zhì)粒pPIC9K-MDAP-2獲得高效表達(dá)，蛋白分子量為7.8 kD，管碟法檢測(cè)重組蛋白對(duì)大腸桿菌與沙門氏菌均具有體外抑菌活性。MDAP-2基因的成功表達(dá)為進(jìn)一步研究表達(dá)產(chǎn)物的生物學(xué)及免疫學(xué)活性奠定基礎(chǔ)。

家蠅抗菌肽(MDAP-2)；畢赤酵母；分泌表達(dá)；抑菌活性

家蠅(Muscadomestica)常生活在多種病原菌孳生的環(huán)境中而自身很少染病，這緣于其體內(nèi)外抗菌活性物質(zhì)作用的結(jié)果[1]，抗菌肽作為家蠅體內(nèi)強(qiáng)效的抗菌活性物質(zhì)之一，其可抑殺多種致病菌、病毒、原蟲，且對(duì)正常生物體細(xì)胞無(wú)破壞作用[2]。因此，本課題組成功克隆得到新型家蠅抗菌肽MDAP-2的核苷酸序列，其開放閱讀框(ORF)198 bp，Genbank登錄號(hào)(KJ787648)，與Genbank上其它抗菌肽基因均不具有同源性，其原核表達(dá)產(chǎn)物對(duì)大腸桿菌、雞白痢沙門氏菌均有體外抑菌活性[3]。由于原核表達(dá)系統(tǒng)缺少蛋白翻譯后修飾和加工，如空間結(jié)構(gòu)的正確折疊，糖基化等特點(diǎn)，很難表達(dá)出具有天然活性的抗菌肽，如果用其作為抗菌物質(zhì)應(yīng)用于臨床，后期處理工序較為復(fù)雜，導(dǎo)致生產(chǎn)成本大幅度增高[4]，使得抗菌肽的臨床應(yīng)用受到一定限制。而畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)在于酵母菌是真核生物，與動(dòng)物細(xì)胞一樣具有轉(zhuǎn)錄、翻譯后加工修飾的功能，表達(dá)出的抗菌肽具有天然活性，并且抗菌肽對(duì)酵母的殺傷力較弱，發(fā)酵生產(chǎn)的抗菌肽不必進(jìn)行復(fù)雜的分離純化[5]，因此，本研究采用PCR技術(shù)擴(kuò)增MDAP-2全長(zhǎng)序列對(duì)其進(jìn)行真核表達(dá)，并對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行生物學(xué)活性分析，為開發(fā)出新一代高效、無(wú)毒、不耐藥可應(yīng)用于臨床的抗菌藥物提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 文庫(kù)及菌株、表達(dá)載體 致病性沙門氏菌誘導(dǎo)家蠅幼蟲cDNA文庫(kù)，3’RACE-Ready cDNA由吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)藥理實(shí)驗(yàn)室完成[6]；實(shí)驗(yàn)菌株E.ColiDH5α、P.pastoris受體菌GS115、表達(dá)載體pPIC9K均由吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)藥理實(shí)驗(yàn)室保存；克隆載體pMD18-T，大連Takara有限公司。

1.1.2 主要試劑 ExTaqTMDNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ、NotⅠ和SacⅠ、DL 2000TMDNA Marker、λ-HindⅢ digest DNA Marker等，大連TaKaRa有限公司；Tris-Tricine-SDS-PAGE凝膠制備試劑盒、超低分子量蛋白Maker，北京索萊寶生物公司；抗生素G418，北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.2 方法

1.2.2MDAP-2全長(zhǎng)基因擴(kuò)增及克隆 以3’RACE-Ready cDNA為模板，P1、P2為引物進(jìn)行PCR反應(yīng)。反應(yīng)體系(25 μL)：模板1 μL，P10.5 μL，P20.5 μL，dNTP1 μL，Taq 酶0.3 μL，10×緩沖液2.5 μL，去離子水19.7 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性1 min，94 ℃變性30 s，53 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，72 ℃總延伸10 min，循環(huán)次數(shù)為32次。

PCR產(chǎn)物回收后與pMD18-T克隆載體連接，轉(zhuǎn)化E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞，重組質(zhì)粒用EcoRⅠ和NotⅠ雙酶切驗(yàn)證為陽(yáng)性，送生物公司測(cè)序并進(jìn)行序列分析。該重組質(zhì)粒命名為pMD18-T-MDAP-2。

1.2.3 重組表達(dá)載體pPIC9K-MDAP-2的構(gòu)建用EcoRⅠ和NotⅠ雙酶切pMD18-T-MDAP-2重組質(zhì)粒和pPIC9k表達(dá)載體，膠回收MDAP-2基因片段和pPIC9k載體片段，連接并轉(zhuǎn)化至E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞，提取質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切(EcoRⅠ和NotⅠ)鑒定，將獲得的陽(yáng)性質(zhì)粒送生物公司測(cè)序并進(jìn)行序列分析。將重組質(zhì)粒命名為pPIC9K-MDAP-2。

1.2.4 pPIC9K-MDAP-2質(zhì)粒轉(zhuǎn)化畢赤酵母 將10 μL經(jīng)SacI限制性內(nèi)切酶線性化后的pPIC9K-MDAP-2的質(zhì)粒，用電穿孔法(1500 V、25 μF、200 Ω、4 ms)轉(zhuǎn)入P.Pastoris(GS115)細(xì)胞并涂布在YPD平板上，pPIC9K 質(zhì)粒含有卡那霉素抗性基因，其轉(zhuǎn)染的宿主菌能抗氨基糖甙類抗生素(G418)。本研究采用含不同濃度G418的YPD平板來(lái)篩選高拷貝轉(zhuǎn)化子，30℃培養(yǎng)至單菌落出現(xiàn)。

1.2.5 重組酵母的PCR鑒定 將篩選后的高拷貝轉(zhuǎn)化子挑取單菌落活化至YPD培養(yǎng)基中，30 ℃培養(yǎng)24 h，提取P.pastoris重組菌基因組，PCR鑒定陽(yáng)性重組酵母菌。PCR條件如下：95 ℃預(yù)變性1 min，94 ℃變性30 s，53 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，72 ℃總延伸10 min，循環(huán)次數(shù)為32次。

1.2.6MDAP-2基因的誘導(dǎo)表達(dá)、表達(dá)產(chǎn)物 Tricine-Tris-SDS-PAGE分析劃線接種陽(yáng)性重組酵母菌于含125 μg/mL的G418的YPD平板上，30 ℃溫箱培養(yǎng)24 h,挑取單菌落接種于5 mL BMGY培養(yǎng)基中，30 ℃搖床(250 r/min)培養(yǎng) 24 h，離心，去上清，轉(zhuǎn)接部分菌體至50 mL BMMY培養(yǎng)基中，使OD值達(dá)到1，隨即加入500 μL 5%甲醇進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá),每隔24 h補(bǔ)加500 μL 5%甲醇,120 h后誘導(dǎo)表達(dá)結(jié)束。同時(shí)以pPIC9K空載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)入P.pastoris(GS115)細(xì)胞的陽(yáng)性重組菌在相同條件下誘導(dǎo)表達(dá)作為陰性對(duì)照。于24、48、72、96 h分別取1 mL菌液樣品，分離樣品，上清液經(jīng)TCA濃縮[7]后加入滅菌水20 μL及20 μL的2×Tricine蛋白上樣緩沖液，沸水裂解10 min，用Tricine-Tris-SDS-PAGE測(cè)定表達(dá)產(chǎn)物的相對(duì)分子量。

1.2.7 重組蛋白的純化及其的活性鑒定 通過(guò)鎳柱純化后的蛋白進(jìn)行Tricine-Tris-SDS-PAGE檢測(cè)純化產(chǎn)物，并用管碟法[8]鑒定純化產(chǎn)物的抑菌活性。取100 μL菌液(105CFU/mL)均勻涂布于LB平板上，放入牛津杯，杯內(nèi)加入50 μL純化后的蛋白，37 ℃培養(yǎng)12 h左右，觀察有無(wú)抑菌環(huán)出現(xiàn)，并檢測(cè)抑菌環(huán)大小。

2 結(jié)果2.1 MDAP-2全長(zhǎng)基因的擴(kuò)增及克隆 MDAP-2基因PCR 產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，可觀察到大小為216 bp的目的條帶(圖1) 。通過(guò)雙酶切鑒定以及序列測(cè)序結(jié)果表明，PCR產(chǎn)物即為 MDAP-2基因的全長(zhǎng)(圖2)。

M：DL2000 DNAMaker；1：MDAP-2全長(zhǎng)基因擴(kuò)增片段圖1 MDAP-2全長(zhǎng)基因的擴(kuò)增結(jié)果

M：DL2000 DNAMaker；1：pMD-18T-MDAP-2重組質(zhì)粒雙酶切圖2 pMD-18T-MDAP-2重組質(zhì)粒的雙酶切鑒定(EcoRⅠ，NotⅠ)

2.2 重組表達(dá)質(zhì)粒pPIC9K-MDAP-2的構(gòu)建和其線性化結(jié)果 通過(guò)雙酶切(圖3) 鑒定時(shí)出現(xiàn)大小為216 bp左右的一條清晰條帶，與目的基因的大小基本相符，序列測(cè)定結(jié)果正確表明重組表達(dá)質(zhì)粒pPIC9k-MDAP-2構(gòu)建成功。pPIC9k-MDAP-2線性化結(jié)果可見大小在9300 bp左右有單一的清晰條帶，表明線性化成功(圖4)。

M1：λ-HindⅢ Marker；M2：DL2000 DNAMaker；1：pPIC9k-MDAP-2重組質(zhì)粒雙酶切(EcoRⅠ，NotⅠ)圖3 pPIC9k-MDAP-2重組質(zhì)粒的雙酶切鑒定

2.3 PCR鑒定重組酵母菌 通過(guò)G418篩選出高拷貝的轉(zhuǎn)化子，提取pPIC9k-MDAP-2重組酵母菌基因組，以其為模板，以P1和P2為引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增出正確條帶(216 bp) (圖5) ，說(shuō)明pPIC9k-MDAP-2穩(wěn)定整合到P.pastoris(GS115)的染色體中。

M：λ-HindⅢ Marker；1：pPIC9k-MDAP-2線性化產(chǎn)物圖4 pPIC9k-MDAP-2重組質(zhì)粒線性化結(jié)果

M：DL2000 DNAMaker；1：pPIC9k-MDAP-2重組酵母菌圖5 GS115-pPIC9k-MDAP-2重組酵母菌PCR鑒定結(jié)果

2.4 pPIC9k-MDAP-2重組質(zhì)粒誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物Tricine-Tris-SDS-PAGE分析 pPIC9k-MDAP-2重組質(zhì)粒誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物的分子量約為7.8 kD，理論上，分子量低于15 kD的多肽在常規(guī)Tris甘氨酸電泳系統(tǒng)中難以得到理想的電泳分辨率。因此使用Tricine(三羥甲基氨基甘氨酸) 代替甘氨酸作為終止離子，使其得到較好的分辨率。在72 h時(shí)經(jīng)甲醇誘導(dǎo)蛋白可見表達(dá)，在96 h時(shí)蛋白表達(dá)條帶較為明顯(圖6)。以96 h經(jīng)甲醇誘導(dǎo)的pPIC9K空載體重組酵母菌作為對(duì)照。

M：超低分子量蛋白Maker；1：pPIC9k-MDAP-2重組質(zhì)粒誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物(72h)；2：pPIC9K空載體誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物；3：pPIC9k-MDAP-2重組質(zhì)粒誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物(96h)圖6 pPIC9k-MDAP-2重組質(zhì)粒誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物Tricine-Tris-SDS-PAGE分析

2.5MDAP-2重組蛋白的純化 純化后的蛋白進(jìn)行Tricine-Tris-SDS-PAGE檢測(cè)，得到一條單一的分子量為7.8 kD的蛋白條帶(圖7)。

M：超低分子量蛋白Maker；1：純化后的MDAP-2重組蛋白圖7 純化后MDAP-2重組蛋白Tricine-Tris-SDS-PAGE分析

1：MDAP-2純化后重組蛋白；N：洗脫液圖8 純化后MDAP-2重組蛋白對(duì)大腸桿菌

1：MDAP-2純化后重組蛋白；N：洗脫液圖9 純化后MDAP-2重組蛋白對(duì)沙門氏菌抑菌活性檢測(cè)

2.6MDAP-2重組蛋白的抑菌活性檢測(cè) 采用管碟法對(duì)純化后的MDAP-2重組蛋白進(jìn)行抑菌活性檢測(cè)，結(jié)果顯示MDAP-2重組蛋白對(duì)大腸桿菌有抑菌活性(圖8)，且對(duì)沙門氏菌具有抑菌活性(圖9)，均以純化洗脫液為對(duì)照。

3 討論

采用畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)對(duì)新型家蠅抗菌肽MDAP-2基因進(jìn)行了表達(dá)，發(fā)酵過(guò)程中外源蛋白產(chǎn)率受到多方面影響如遺傳因素和培養(yǎng)條件，本研究采用序列優(yōu)化的方法，添加增強(qiáng)真核基因翻譯效率的kozak序列，并采用分批培養(yǎng)的方法，較連續(xù)培養(yǎng)相比其優(yōu)勢(shì)在于可以達(dá)到較高的細(xì)胞密度且便于控制。結(jié)果表明，經(jīng)過(guò)優(yōu)化的序列以及嚴(yán)格的控制培養(yǎng)條件使MDAP-2獲得高效表達(dá)。在對(duì)MDAP-2進(jìn)行體外抑菌活性檢測(cè)時(shí)，為排除酵母發(fā)酵產(chǎn)生乙醇的干擾將上清液凍干后用無(wú)菌水溶解，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其表達(dá)產(chǎn)物對(duì)大腸桿菌、沙門氏菌均具有較高的抑菌活性，說(shuō)明經(jīng)過(guò)真核表達(dá)修飾加工后具有天然N端的家蠅抗菌肽MDAP-2蛋白接近于天然蛋白的構(gòu)象，具有較高的生物學(xué)活性。真核生物細(xì)胞膜表面大量的膽固醇和膜蛋白，使其趨于穩(wěn)定, 可抵御抗菌肽的殺細(xì)胞作用，這就決定了抗菌肽對(duì)正常的真核細(xì)胞的生長(zhǎng)沒(méi)有影響[9]，因此，家蠅抗菌肽MDAP-2對(duì)酵母細(xì)胞的殺傷力較弱，其表達(dá)效率較高，發(fā)酵生產(chǎn)的抗菌肽不必進(jìn)行復(fù)雜的分離純化，可以直接作為飼料添加劑應(yīng)用于臨床，具有更為廣泛的應(yīng)用前景。

近年來(lái)，畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)得到了優(yōu)化，Wu等[10]利用AOX1和GAP啟動(dòng)子組合共表達(dá)重組蛋白表達(dá)效率會(huì)比單獨(dú)使用AOX1啟動(dòng)子高約兩倍；王慧等[11]利用雙質(zhì)粒共表達(dá)體系提高融合蛋白在畢赤酵母中的表達(dá)量；付玲等[12]優(yōu)化了pPIC9k表達(dá)載體，彌補(bǔ)了一些常用載體的不足之處，無(wú)論在克隆方式還是在對(duì)外源蛋白的分泌表達(dá)提高方面都有一定的改進(jìn)。今后研究中，可根據(jù)畢赤酵母的偏嗜性優(yōu)化密碼子、應(yīng)用AOX1和GAP啟動(dòng)子組合共表達(dá)重組蛋白等方法來(lái)提高M(jìn)DAP-2蛋白的表達(dá)量，為家蠅抗菌肽MDAP-2應(yīng)用于臨床進(jìn)行進(jìn)一步摸索。

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(編輯：陳希)

Eukaryotic Expression of a Novel Antimicrobial Peptide Gene (MDAP-2) fromMuscadomesticaLarvae and Its Antibacterial Activity

LI Wen-ting1, YAN Shu1, ZHANG Dan-dan1, JIA Bo-yan, TANG Yan1, KONG Ling-cong1, PEI Zhi-hua1, LIU Shu-ming1, MA Hong-xia1,2*

(1.CollegeofAnimalScienceandTechnology,JilinAgriculturalUniversity,Changchun130118,China; 2.AnimalProduction&ProductQualityandSecurityoftheMinistryofEducation,JilinAgriculturalUniversity,Changchun130118,China)

Pichiapastorisexpression system was applied to express a novel antimicrobial peptideMDAP-2 gene fromMuscadomestica, which provide experimental evidence forMDAP-2 used as a new antimicrobial substance in clinical application.Based on the amino acid sequence of antibiotical peptideMDAP-2, which was previously identified, polymerase chain reaction (PCR) technique was performed to amplified theMDAP-2 gene, and eukaryotic recombinant expression plasmid pPIC9K-MDAP-2 was constructed, subsequently the recombinant plasmid was digested used to transformed thePichiapastoris(GS115 cells) through electroporation.The positive recombinant pPIC9k-MDAP-2 which detected by PCR induced by addition of methanol, using tricine-SDS-PAGE detected the weight of recombinantMDAP-2 protein.The recombinantMDAP-2 was purified using Ni-NTA HisTrap FF crude column chromatography and the bacteriostatic activity of the recombinant purifiedMDAP-2 protein was assessed by tube plate method.The test results showed that the molecular weight of recombinantMDAP-2 protein was about 7.8 kD,MDAP-2 had in vitro antibacterial activity againstEscherichiacoliandSalmonellapullorum.TheMDAP-2 gene was expressed successfully inPichiapastorisexpression system which provide reference for further research in the biological and immunologic activities ofMDAP-2.

MuscadomesticaMDAP-2;Pichiapastoris; secretory expression; antibacterial activity

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(31140026，31572574，31502121)；吉林省世行貸款農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全項(xiàng)目(2011-Y05)

李文婷，碩士研究生，從事動(dòng)物藥理和毒理學(xué)研究。

馬紅霞。E-mail：hongxia0731001@163.com

2015-07-23

A

1002-1280 (2015) 11-0011-06

S852.6