武桂梅，王振輝*，何玉友，李鵬，鄭洪娟

(1.吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院，吉林132101； 2.吉林正業(yè)生物制品股份有限公司，吉林132101)

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膜分離法純化濃縮的豬細小病毒滅活疫苗效果研究

武桂梅1，王振輝1*，何玉友2，李鵬1，鄭洪娟2

(1.吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院，吉林132101； 2.吉林正業(yè)生物制品股份有限公司，吉林132101)

為了研究純化濃縮的豬細小病毒滅活疫苗的免疫效果，應(yīng)用微濾/超濾管式陶瓷膜分離系統(tǒng)對豬細小病毒細胞收獲液進行純化濃縮，使?jié)饪s液病毒平均含量由104.7TCID50/mL提高到106.5TCID50/mL；將純化濃縮的病毒液經(jīng)檢驗合格后，進行甲醛滅活，與注射用礦物白油佐劑制成油包水滅活疫苗；按照豬細小病毒滅活疫苗的質(zhì)量標準，對制備的滅活疫苗進行檢驗與免疫效果試驗。結(jié)果顯示：純化濃縮的豬細小病毒液雜蛋白去除率平均達到71.6%左右；制備的三組滅活疫苗檢驗均合格；免疫至63 d時，免疫豬體內(nèi)抗豬細小病毒抗體(HI)水平分別為：純化濃縮的滅活疫苗平均高達9.62 log2稀釋倍數(shù)，常規(guī)疫苗平均為8.78 log2稀釋倍數(shù)，差異顯著(P<0.05)。試驗表明：疫苗病毒細胞收獲液進行膜純化技術(shù)處理后，免疫效果顯著優(yōu)于未經(jīng)純化的常規(guī)滅活疫苗。

豬細小病毒；純化濃縮；滅活疫苗；免疫效果

豬細小病毒(Porcine parvovirus, PPV)是引起母豬繁殖障礙的重要病原之一，可導(dǎo)致母豬流產(chǎn)、早產(chǎn)、產(chǎn)死胎、木乃伊胎、弱仔及母豬不育和新生仔豬大量死亡，疫苗接種是控制PPV感染的最有效措施[1]。張超范等研究豬細小病毒滅活疫苗發(fā)現(xiàn)病毒含量與疫苗的免疫效果密切相關(guān)，且最大程度降低犢牛血清含量來減少滅活疫苗的副反應(yīng)[2-3]。目前，國內(nèi)獸醫(yī)生物制品行業(yè)制備動物疫苗的病毒細胞收獲液基本是未經(jīng)純化的，含有大量與免疫無關(guān)的非特異蛋白質(zhì)等雜質(zhì)，這些雜質(zhì)無疑會導(dǎo)致一些畜禽個體免疫麻痹或失敗[4]。國內(nèi)關(guān)于豬細小病毒滅活疫苗免疫效果的研究較多，但有關(guān)對豬細小病毒進行純化濃縮的研究很少。為了探索純化濃縮的病毒滅活疫苗免疫效果，應(yīng)用膜分離技術(shù)[5]對某生物制品廠提供的病毒含量低的豬細小病毒細胞收獲液進行雜蛋白濾除，并制成油乳劑滅活疫苗進行了免疫效果試驗。

1 材料和方法

1.1 微濾/超濾管式陶瓷膜分離系統(tǒng) 型號：SY-MU-2-500,管式陶瓷膜元件孔徑1.0 μm、0.80 μm、0.60 μm、0.22 μm，管式有機膜元件(改良纖維素)5K， 由吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院生物制藥實驗室提供。

1.2 豬細小病毒細胞收獲液 吉林正業(yè)生物制品股份有限公司提供120000 mL(病毒含量為104.7TCID50/mL)，國內(nèi)三家獸醫(yī)生物制品廠生產(chǎn)的未純化的常規(guī)豬細小病毒滅活疫苗(各500頭份，編號：對照01、對照02與對照03)。

1.3 細胞與試劑 仔豬腎傳代細胞(IBRS-2)，豬細小病毒標準陽性血清(批號20110901)、豬細小病毒標準陰性血清(批號20110707)均由吉林正業(yè)生物制品股份有限公司提供。

1.4 試驗動物 4日齡同窩乳鼠、350～400 g的豚鼠均由吉林正業(yè)生物制品股份有限公司提供；2月齡仔豬(豬瘟中和抗體陰性、豬細小病毒HI抗體效價≤3 Log2)由吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院實習(xí)豬場提供。

1.5 不同膜組合對豬細小病毒收獲液的純化與濃縮 分三組進行：1組(1.0 μm、5K、0.22 μm)陶瓷膜過濾；2組(0.80 μm、5 K、0.22 μm)陶瓷膜過濾；3組(0.60 μm、5K、0.22 μm)陶瓷膜過濾。先分別用1.0 μm、0.80 μm、0.60 μm陶瓷膜過濾雜蛋白，再用5K陶瓷膜濃縮病毒，最后用0.22 μm除菌處理。每組膜純化濃縮處理40 000 mL未處理的豬細小病毒滅活液，

1.6 病毒含量測定、雜蛋白去除率、病毒滅活與無菌檢驗

1.6.1 病毒含量測定 用DMEM培養(yǎng)液將純化濃縮前后的豬細小病毒細胞收獲液作10倍系列稀釋，取10-3、10-4、10-5、10-6、10-75個稀釋度，分別接種于已生長良好的單層IBRS-2細胞的96孔細胞微量培養(yǎng)板，每個滴度接種5孔，每孔100 μL，置37 ℃含5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24～120 h，每日觀察并記錄細胞病變，按Reed-Muench法計算病毒的半數(shù)感染量(TCID50/mL)。

1.6.2 雜蛋白去除率、病毒滅活與無菌檢驗 三組純化濃縮前后的豬細小病毒液分別用紫外分光光度計檢測總蛋白含量，計算雜蛋白去除率[6]；病毒滅活檢驗，將純化濃縮滅活的病毒原液分別接種于已生長良好的單層IBRS-2細胞的96孔細胞微量培養(yǎng)板，每個樣品接種10孔，每孔100 μL，置37 ℃含5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24～120 h，每日觀察并記錄細胞病變；純化后滅活病毒液分別用硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基(TG)、酪胨瓊脂培養(yǎng)基(GA)、葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基(GP)按《中華人民共和國獸藥典》[7]的方法進行無菌檢驗。

1.7 純化濃縮的豬細小病毒滅活疫苗制備 三組純化濃縮的滅活病毒液各取1500 mL制備5000 mL滅活疫苗。其中油相制備、水相制備、乳化、黏度檢驗、分裝按文獻方法[5]進行制備。

1.8 純化濃縮的豬細小病毒滅活疫苗檢驗 按《中華人民共和國獸藥典》[7]進行黏度、無菌檢驗、安全檢驗、效力檢驗。

1.9 純化濃縮的豬細小病毒滅活疫苗免疫試驗

1.9.1 仔豬分組與免疫 根據(jù)試驗內(nèi)容，選用2月齡斷奶仔豬60頭(母原抗體平均≤4 Log2)，隨機平均分為6組。第1、2、3組每頭仔豬對應(yīng)接種三組純化濃縮的豬細小病毒滅活疫苗2 mL；第4、5、6組為未純化的滅活疫苗免疫對照組，每頭仔豬接種常規(guī)豬細小病毒滅活疫苗2 mL。

1.9.2 抗體中和效價測定 分別于免疫后第0、7、14、21、28、35、42、49、63 d對6組試驗豬耳靜脈無菌采血，分離血清滅活后，分別用豬細小病毒標準陽性血清、豬細小病毒標準陰性血清、標準的豬細小病毒病毒抗原，用1%健康豚鼠的紅細胞懸液進行HI血凝抑制試驗[8-9]，測定抗體HI效價。

2 結(jié)果與分析

2.1 病毒含量、雜蛋白去除率、病毒滅活與無菌檢驗 結(jié)果見表1。由于三組微孔陶瓷膜的孔徑分別是1.0 μm、0.8 μm、0.6 μm，所以三組純化濃縮病毒含量顯著提高，平均病毒含量達到106.5TCID50/mL；病毒收獲量由高到低，蛋白質(zhì)去除率由低到高，三組平均雜蛋白去除率為71.6%。三組純化濃縮的病毒液濃縮倍數(shù)均高達10以上，滅活與無菌檢驗均合格。

表1 病毒含量、雜蛋白去除率、滅活與無菌檢驗結(jié)果

蛋白去除率=(純化前蛋白質(zhì)含量×純化前投入量-純化后蛋白質(zhì)含量×純化后收獲量)÷(純化前蛋白質(zhì)含量×純化前投入量)×100%

2.2 純化濃縮的滅活疫苗檢驗 結(jié)果見表2。三組滅活疫苗由于純化濃縮平均去除雜蛋白達到71.6%，大大減少雜蛋白對安全檢驗、效力檢驗的影響，達到檢驗一次通過率，全部合格。

表2 純化濃縮的豬細小病毒滅活疫苗檢驗結(jié)果

2.3 純化濃縮的滅活疫苗與未純化的滅活疫苗免疫豬血清HI檢測 結(jié)果見表3。免疫28 d時，純化濃縮的滅活疫苗和未純化的對照滅活疫苗血清抗體平均升至最高，純化的三組滅活疫苗血清抗體消長差異不顯著(P>0.05)，抗體效價平均為10.80 log2稀釋倍數(shù)；未純化的對照三組滅活疫苗血清抗體消長差異不顯著(P>0.05)，平均為9.90 log2稀釋倍數(shù)；純化的滅活疫苗比未純化的對照滅活疫苗血清抗體消長差異顯著(P<0.05)。免疫63 d時，純化的三組滅活疫苗血清抗體平均消長差異不顯著(P>0.05)，平均為9.62 log2稀釋倍數(shù)；而未純化的對照滅活疫苗血清抗體消長差異不顯著(P>0.05)，平均為8.78 log2稀釋倍數(shù)；純化的滅活疫苗比對照滅活疫苗血清抗體消長差異極顯著(P<0.05)。

表3 不同免疫時間純化組與未純化組滅活疫苗豬血清HI抗體監(jiān)測結(jié)果 log2

同列肩標不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)

3 討論

通過使用1.0 μm、0.80 μm、0.60 μm三種微孔陶瓷膜過濾，首先濾除病毒液中細胞碎片、犢牛血清中與免疫無關(guān)的雜蛋白，然后使用5K的改良纖維素超濾膜濾除病毒液中多余的水分子，使病毒液得到純化濃縮，顯著提高了病毒含量，最后使用0.22 μm微孔濾膜進行除菌處理，避免了雜蛋白、細菌及其毒素對疫苗病毒抗原的免疫效果影響。

通過微濾、超濾、除菌處理使含毒病毒液濃縮倍數(shù)達到10倍之多，病毒平均含量由最初的104.7TCID50/mL提高到106.5TCID50/mL，雜蛋白去除率平均達到71.6%左右。由于三組微孔膜差異小，故純化濃縮后三組之間檢測數(shù)據(jù)差異不顯著。三組純化濃縮的病毒液制備的滅活疫苗的各項檢驗均一次檢驗合格，較某生物制品廠同類產(chǎn)品復(fù)檢合格比較，說明雜質(zhì)含量與疫苗質(zhì)量關(guān)系密切。純化濃縮的滅活疫苗與對照常規(guī)滅活疫苗免疫豬血清抗體效價數(shù)據(jù)分析，不同免疫日齡檢測抗體水平數(shù)據(jù)表明：純化的疫苗抗體數(shù)值顯著高于未純化的常規(guī)疫苗。

目前，為了提高疫苗的抗原蛋白含量，多數(shù)獸醫(yī)生物制品廠家應(yīng)用頗爾過濾器(PALL)對病毒細胞收獲液或組織收獲液進行超濾濃縮除去多余的水分子等低分子物質(zhì)，但該設(shè)備只能濃縮，不能截留除去細胞膜碎片等大分子雜蛋白，提高了病毒含量的同時也提高了雜質(zhì)的含量，增加了對疫苗免疫的影響因素。目前，國內(nèi)膜的種類功能繁多、膜分離設(shè)備有開放式和密閉循環(huán)式多種，非常適合細菌、病毒、蛋白質(zhì)、酶的分離純化濃縮。

由于對病毒的純化濃縮，增加了生產(chǎn)成本，而且膜分離設(shè)備和膜價格較高且操作具有一定的技術(shù)難度，所以未被獸醫(yī)生物制品行業(yè)廣泛開發(fā)研究利用。但人用疫苗的病毒和細菌培養(yǎng)物都是經(jīng)過純化的，基本沒有副反應(yīng)。所有病毒、細菌、蛋白質(zhì)、酶、核酸的純化濃縮工藝中膜分離技術(shù)是最快捷、回收率最高的[10]。本試驗處理的病毒液是某獸醫(yī)生物生物制品廠檢驗病毒含量低不能用于制備疫苗的，試驗結(jié)果表明，膜分離技術(shù)非常適合報廢的病毒液或滅活的病毒液純化濃縮，做到廢物回收利用，降低了生產(chǎn)成本，提高了疫苗的質(zhì)量。膜分離注意事項是膜的孔徑要比目的物的分子量大10倍左右，如果純化的是活病毒盡量不用除菌處理，以免滅活病毒，循環(huán)流量和循環(huán)壓力[10]盡可能低一些，避免生物活性被破壞。本試驗是分段間歇性處理病毒液，下一步將研究密閉可循環(huán)式的串濾膜分離操作，達到一次產(chǎn)出合格的產(chǎn)品，提高收率和質(zhì)量。

[1] 呂建強,陳煥春,趙俊龍,等.豬細小病毒-偽狂犬病病毒二聯(lián)油乳劑滅活疫苗的研制[J].中國獸醫(yī)雜志,2005, 41(6):17-20.

[2] 張超范,崔尚金,苗嵐飛,等.豬細小病毒滅活疫苗安全性試驗及佐劑的篩選[J].中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報,2009,31 (6):462-465.

[3] 張振梅,張超范,崔尚金,等.豬細小病毒BQ株滅活疫苗免疫劑量及免疫持續(xù)期的初步研究[J].中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報,2010,32(5):394-397.

[4] 王金華.豬瘟疫苗注射變態(tài)反應(yīng)1例[J].黑龍江畜牧獸醫(yī),2002,3:58-59.

[5] 武桂梅,王振輝,張桂榮,等.通過膜分離法純化豬瘟疫苗的效果分析[J].中國獸醫(yī)雜志,2011,47(7):25-26.

[6] 王冬梅,呂淑霞,王金勝.生物化學(xué)實驗指導(dǎo)(第一版)[M].北京:科學(xué)出版社,2009: 1-27.

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[9] 張道華,張雪花,唐波,等.豬細小病毒滅活疫苗NJ株毒種分離與鑒定[J].江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報,2012,28(1):99-103.

[10]吳梧桐.生物制藥工藝學(xué)(第二版)[M].北京:中國醫(yī)藥科技出版社,2006: 325-363.

(編輯：李文平)

Research on the Effect of Purified and Concentrated Porcine Parvovirus Inactivated Vaccine by Membrane Separation

WU Gui-mei1, WANG Zhen-hui1*, HE Yu-you2, LI Peng1, ZHENG Hong-juan2

(1.JilinAgriculturalScienceandTechnologyCollege,Jilin132101,China;2.JilinZhengYeBiologicalProductsCo.Ltd.,Jilin132101,China)

This research aims to test the immune effect of the purified and concentrated porcine parvovirus inactivated vaccine.The average amount of the porcine parvovirus was increased from 104.7TCID50/mL to 106.5TCID50/mL by applying the microfiltration/ultrafiltration tubular ceramic membrane system to purify and concentrate the porcine parvovirus vaccine cells liquid.Next, the purified concentrated porcine parvovirus virus was inactivated by formaldehyde and passed the test.Then it was used to produce the water-in-oil inactivated vaccines along with the injectable mineral white oil.In accordance with the quality standard of viral inactivation vaccine for Porcine Parvovirus, the immune effect tests have been done.The result show that: the removal rate of impure protein in porcine parvovirus virus liquid is about 71.6%.All three groups of the produced inactivated vaccine meet the standard.After 63 days immunization, the porcine parvovirus antibody level (HI) in immunized pigs is: 9.62 log2dilution ratio in average for purified and concentrated inactivated vaccine and 8.78 log2dilution ratio for conventional vaccines respectively.The difference is significant(P<0.05).The test shows that: the immune effect of inactivated vaccine with inactivated virus liquid membrane purification process was significantly better than the normal vaccines without the purification.

porcine parvovirus virus; purified and concentrated; inactivated vaccine; immune effect

吉林省教育廳“十一五”科研項目(吉教科合字[2008]第245號)

武桂梅，實驗師，從事獸醫(yī)生物制品實驗教學(xué)研究。

王振輝。E-mail:yaowu108@sohu.com

2015-08-13

A

1002-1280 (2015) 11-0049-04

S858.28