肖勝南 張云卿 侯 婷 王 巍 薛 飛 王 瑾 楊龍峰

（北京市延慶縣動物疫病預(yù)防控制中心，北京 102100）

PAG-ELISA 在奶牛早期妊娠診斷上的應(yīng)用研究

肖勝南 張云卿 侯 婷 王 巍 薛 飛 王 瑾 楊龍峰*

（北京市延慶縣動物疫病預(yù)防控制中心，北京 102100）

本課題研究旨在針對人工輸精后的28～45 d的奶牛，分別采用PAG-ELISA方法和B超檢測進行早期妊娠診斷，比較實驗結(jié)果，評價PAG-ELISA檢測方法對配種28～45 d的奶牛進行早期妊娠診斷的準(zhǔn)確性。結(jié)果表明，PAG-ELISA妊娠診斷的特異性、敏感性、陰性預(yù)測值、陽性預(yù)測值和準(zhǔn)確性分別為93.2%、100%、100%、97.4% 和98.1%，Kappa為0.952。PAG-ELSIA 檢測方法和B超妊娠診斷結(jié)果符合率高，可用于母牛的早期妊娠診斷。

PAG-ELISA B超檢查 早期妊娠診斷

開展精準(zhǔn)及時的奶牛早期妊娠診斷在現(xiàn)代規(guī)模養(yǎng)殖場中對于易流產(chǎn)母牛的保胎、牛群的分群管理及提高繁殖效率等有著舉足輕重的作用。目前，國內(nèi)主要依賴B超、直腸觸診進行奶牛早期妊娠診斷，而國外奶牛養(yǎng)殖發(fā)達(dá)國家除了采取B超、直腸觸診進行奶牛早期妊娠診斷外，采取檢測血液中妊娠相關(guān)糖蛋白（PAGELISA方法）進行奶牛早期妊娠診斷，并得到快速推廣與應(yīng)用。據(jù)相關(guān)資料調(diào)查，國內(nèi)某些大型牧場也開始使用PAG-ELISA方法進行奶牛早期妊娠診斷，但對其臨床使用效果及其影響評估資料甚是欠缺。

為了分析、利用、評估PAG-ELISA檢測奶牛早期妊娠診斷的實際應(yīng)用效果與影響，筆者通過B超、妊娠相關(guān)糖蛋白ELISA兩種方法臨床試驗比較研究，于2014年1～5月對延慶縣4個牛場260頭配種后28～45 d的荷斯坦奶牛使用基于妊娠相關(guān)糖蛋白PAGELISA的商品化試劑盒進行早期孕檢診斷，并在采集血樣的同一時間開展B超妊娠診斷確認(rèn)，比較分析快速PAG-ELISA的實際應(yīng)用效果與影響，為PAG-ELISA 推廣應(yīng)用提供參考依據(jù)。

I 材料與方法

1.1 試驗動物

選取配種后28～45 d的荷斯坦黑白花奶牛260頭，采集靜脈血液4 ml，送檢實驗室進行PAG-ELISA快速妊娠診斷。

1.2 試劑

牛懷孕檢測試劑盒由北京愛德士元亨生物科技有限公司提供。批次04-41169-02，有效期至2014年5月31日。

1.3 PAG-ELISA方法原理

反芻動物胎兒胎盤的滋養(yǎng)層雙核細(xì)胞在與母體子宮上皮細(xì)胞融合時，會釋放包括PAG在內(nèi)的物質(zhì)到母畜血液中。PAG的濃度隨著妊娠開始呈緩慢上升，直至分娩；相關(guān)研究表明，配種1個月后妊娠奶牛與非妊娠奶牛PAG濃度出現(xiàn)顯著差異。因此，在此時檢測PAG可以成為盡早診斷奶牛妊娠與否的關(guān)鍵指標(biāo)。IDEXX牛懷孕檢測試劑盒是根據(jù)酶聯(lián)免疫反應(yīng)原理設(shè)計的，用于檢測妊娠早期存在外周循環(huán)中的PAG，通過微孔板包被純化的PAG抗體，捕獲到的外周循環(huán)中的PAG可以與特異性的純化的PAG抗體和辣根過氧化物酶標(biāo)記物結(jié)合，隨后加入TMB底物溶液顯色，孔內(nèi)溶液的顏色深淺與樣品中PAG的含量成比例，此判斷妊娠與否。

1.4 IDEXX牛懷孕檢測試劑盒操作步驟及結(jié)果判讀

將待檢奶牛血清和IDEXX 牛懷孕檢測試劑盒恢復(fù)到室溫，按照試劑盒說明書操作步驟進行，檢測待檢奶牛的妊娠狀況。

陽性對照的平均值（PC）與陰性對照的平均值（NC）之差必須大于或等于0.300，另外，陰性對照的平均值（NC）必須小于或等于0.150，實驗結(jié)果才有效。

具體結(jié)果詮釋方法為：動物的懷孕狀態(tài)是由計算每份樣品的S-N值決定的。被檢樣品的S-N值＜0.300的，檢測結(jié)果為陰性，表示此動物沒有懷孕（空懷）；被檢樣品的S-N值≥0.300的，檢測結(jié)果為陽性，表示此動物被認(rèn)為是懷孕。

1.5 奶牛懷孕B超檢查結(jié)果判斷

經(jīng)過PAG ELISA 妊娠診斷，做好相關(guān)檢測結(jié)果，并在同一時間進行B超妊娠診斷確認(rèn)。B超妊娠診斷未懷孕奶牛為空懷牛，若懷孕診斷為妊娠牛。

1.6 結(jié)果分析

在結(jié)果判定中，特異性為空懷牛樣品中PAG檢測結(jié)果為陰性的比例；敏感性為妊娠牛樣品中PAG酶聯(lián)免疫法檢測結(jié)果為陽性的比例；結(jié)果的陰性預(yù)測值為PAG檢測為空懷的牛確定為真實為空懷的比例；結(jié)果的陽性預(yù)測值為PAG檢測為已孕的牛確定為真實妊娠的比例；結(jié)果的準(zhǔn)確性為PAG檢測的妊娠狀況（妊娠+空懷）與B超診斷結(jié)果一致的比例。

1.7 統(tǒng)計與分析指標(biāo)

利用Kappa值對懷孕相關(guān)蛋白PAG-ELISA 同B超診斷結(jié)果進行一致性評價。Kappa值為1表明完全符合，0為完全不符。在比較性試驗中，Kappa值在0.4～0.5之間，說明符合率中等；0.5～0.6說明符合率良好；大于0.6說明符合率很高。

2 結(jié)果與分析

在試驗期間，對260頭奶牛分別使用B超檢查（配種后28～45 d）和PAG-ELISA試劑盒2種方法進行妊娠診斷，對獲得的結(jié)果進行比對分析。檢測結(jié)果：利用PAG ELISA試劑盒共檢測出69頭奶牛陰性（空懷），191頭奶牛陽性（懷孕）。在用B超檢查時發(fā)現(xiàn)，使用PAG ELISA試劑盒檢測為陰性（空懷）的69頭牛全部為空懷。

PAG-ELISA 檢測為陽性（懷孕）的191頭牛中，用 B超檢查時發(fā)現(xiàn)其中的186頭已孕，而5頭為空懷。為了分析PAG ELISA試劑盒檢測結(jié)果的敏感性、特異性、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值和準(zhǔn)確性，建立了2×2列聯(lián)表（見表1），并在表2中列出了以B超為標(biāo)準(zhǔn)，評估PAG ELISA試劑盒的準(zhǔn)確性。

從表1可以得出，PAG ELISA試劑盒妊娠診斷的特異性、敏感性、陰性預(yù)測值、陽性預(yù)測值和準(zhǔn)確性分別為93.2%、100%、100%、97.4% 和98.1%，Kappa為0.952。PAG ELSIA 試劑盒和B超妊娠診斷結(jié)果符合率極高

為了解PAG-ELISA 妊娠診斷結(jié)果的特異性①、敏感性②、陰性預(yù)測值③、陽性預(yù)測值④和準(zhǔn)確性⑤的2×2列聯(lián)表評估表（N＝260），詳見表1。

表1 PAG-ELISA 妊娠診斷和B超妊娠診斷情況比較

人工配種后通過B超診斷評價PAG-ELISA方法的特異性、敏感性、陰性預(yù)測值、陽性預(yù)測值和準(zhǔn)確性，結(jié)果詳見表2。

表2 B超評價PAG-ELISA方法的結(jié)果統(tǒng)計

本研究結(jié)果表明：兩種妊娠診斷方法的一致率=（a+d）/ N*100=（186+69）/260=0.981。表1數(shù)據(jù)代入Kappa方程，Kappa值為0.952，分析得出，本試驗表明PAG ELISA方法和B超診斷兩種妊娠診斷結(jié)果符合率很高，應(yīng)用PAG ELISA 方法完全能夠用于奶牛早期妊娠診斷。

在本研究中，PAG ELISA試劑盒檢測母牛妊娠診斷的特異性、敏感性、陰性預(yù)測值、陽性預(yù)測值和準(zhǔn)確性分別為93.2、100、100、97.4 和98.1，與B超診斷結(jié)果相同，表明該方法可用于奶牛的早期妊娠診斷。Silva等評估PAG判斷妊娠狀況準(zhǔn)確性試驗中得出，PAG檢測方法的敏感性、特異性、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值和準(zhǔn)確性分別為96.8%～98.9%、91.7%～97.3%、89.7%～93.8%、97.5%～99.5% 和93.9%～97.8%，本研究與Silva等的研究一致。數(shù)據(jù)表明采用PAG ELISA試劑盒檢測奶牛早期妊娠診斷的敏感性和陰性預(yù)測值均很高，便于篩查空懷牛，利于讓技術(shù)員查找原因，盡早采取相關(guān)措施，如病原性開展治療、健康的準(zhǔn)備再次配種，以縮短產(chǎn)犢間隔，提高牧場的生產(chǎn)效益。

3 討論

據(jù)資料調(diào)查，揚州大學(xué)動物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院賈國慧、王杏龍、王亮等在《奶牛B超妊娠診斷應(yīng)用研究》的比較實驗中，B超在奶牛配種后29～60 d診斷準(zhǔn)確率均為100%，故本實驗選擇在28～45 d期間采用PAG-ELISA 與B超同一時間進行妊娠診斷，在保證時間的統(tǒng)一下也保證B超檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。陽性預(yù)測值沒有達(dá)到100%，這可能是在奶牛懷孕早期，胚胎早期死亡，用B超檢測不到胚胎，檢測結(jié)果為陰性，但是血液中PAGs蛋白還是在會在母牛體內(nèi)存在及循環(huán)一段時間，從而導(dǎo)致PAG-ELISA檢測出現(xiàn)假陰性現(xiàn)象?；谠诒敬窝芯空n題中陰性預(yù)測值100%，未出現(xiàn)假陽性，這一檢測指標(biāo)對牧場的繁殖管理至關(guān)重要，繁育人員不會錯誤的為已妊娠牛只進行再次配種處理，造成妊娠奶牛流產(chǎn)。

通過B超與PAG ELISA檢測方法的比較研究，PAG-ELISA檢測方法是可靠的、準(zhǔn)確的。尤其適用于大型牧場，這對牧場的進一步標(biāo)準(zhǔn)化，規(guī)范化管理，提高生產(chǎn)養(yǎng)殖效益有著不可低估的作用；相關(guān)地區(qū)部門也可用此診斷方法，適當(dāng)收取檢測費用，組織當(dāng)?shù)啬翀霾捎肞AG ELISA方法開展奶牛早期妊娠診斷，這對提升當(dāng)?shù)啬膛ｐB(yǎng)殖技術(shù)水平，提高牧場養(yǎng)殖生產(chǎn)效益有很大的促進作用。

4 存在的問題及展望

近年來，應(yīng)用PAG-ELISA方法來進行奶牛早期妊娠診斷取得了很大的進步，但還存在著一些局限性。一是該方法進行奶牛早期妊娠診斷需要配備相關(guān)的檢測設(shè)備，一般奶牛場無法獨立完成，需要送檢相關(guān)實驗室開展檢測。二是對配種28d以內(nèi)奶牛妊娠診斷的準(zhǔn)確性有待進一步提高；三是檢測成本費用高，據(jù)調(diào)查，國內(nèi)還未研發(fā)相關(guān)成熟產(chǎn)品，均采用進口檢測試劑盒，檢測成本高，檢測費用在40～50元一頭。

參考最新放射免疫和酶聯(lián)免疫等技術(shù)的發(fā)展趨勢，隨著檢測技術(shù)的不斷發(fā)展與更新，檢測血清中PAG的檢測方法也將更簡便，檢測結(jié)果也將更準(zhǔn)確，檢測成本將會更低廉，檢測PAG方法大范圍推廣應(yīng)用，替代直腸檢測、黃體酮檢測、B超等傳統(tǒng)早期妊娠診斷方法將會成為現(xiàn)實，這將推動奶牛業(yè)發(fā)展到一個新的生產(chǎn)水平。

[1] 李艷艷，胡建宏，雷靜，等.牛妊娠相關(guān)糖蛋白ELISA對早期妊娠診斷效果的影響[J].家畜生態(tài)學(xué)報，2Ol3，34（3）：54-57.

[2] 賈國慧，王杏龍，王亮，等.奶牛B超妊娠診斷應(yīng)用研究[J].上海畜牧獸醫(yī)通訊，2009，（1）：8-9.

[3] 鐘旭，薛立群，田見暉，等.妊娠相關(guān)糖蛋白（PAG）在奶牛早期妊娠診斷上的應(yīng)用現(xiàn)狀[J].中國畜牧獸，2Ol1，38（11）：140-143.

得到現(xiàn)代奶牛產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系北京市創(chuàng)新團隊，2013年國家自然科學(xué)基金項目（71373025），2010年教育部新世紀(jì)優(yōu)秀人才支持計劃項目（NCET-10-009資助）。

肖勝南（1981-），研究生，研究方向：動物疫病診斷與畜牧技術(shù)推廣。

楊龍峰（1976-），男，研究生，研究方向：動物疫病防制及畜牧技術(shù)推廣。