劉艷平　馬　麗

哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院　1　干部病房　2　消化內(nèi)科，黑龍江省哈爾濱市　150001

論著

致敏樹突狀細(xì)胞治療小鼠肝癌的實(shí)驗(yàn)研究*

劉艷平1馬麗2

哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院1干部病房2消化內(nèi)科，黑龍江省哈爾濱市150001

摘要目的：探討肝癌細(xì)胞致敏的樹突狀細(xì)胞(DC)治療小鼠肝癌的作用。方法：取BALB/c小鼠脛骨和股骨的骨髓細(xì)胞，應(yīng)用rmIL-4、rmGM-CSF、 LPS、RPMI-1640培養(yǎng)基制備DC。H22小鼠肝癌細(xì)胞滅活后與DC按1∶3混合培養(yǎng)，制備肝癌細(xì)胞致敏的DC(DC-H22)。實(shí)驗(yàn)分為DC治療組、DC-H22治療組、生理鹽水治療組。各組分別腹腔注射后2周觀察腫瘤體積的變化、抑瘤率及生存期。結(jié)果：(1)治療前各組間的腫瘤體積基本相同，不同治療2周后，DC治療組、DC-H22治療組小鼠腫瘤體積較生理鹽水治療的對(duì)照組顯著性減小，說明DC及DC-H22治療小鼠肝癌可以顯著抑制皮下移植腫瘤的生長(zhǎng)，而H22致敏的DC對(duì)腫瘤的抑制程度更大。(2)DC治療組、DC-H22組治療2周后，其抑瘤率分別為31.08%、68.30%，小鼠的存活期亦較鹽水對(duì)照組延長(zhǎng)。結(jié)論：小鼠肝癌細(xì)胞致敏的樹突狀細(xì)胞能夠更好地抑制小鼠肝癌的生長(zhǎng)，對(duì)肝癌的治療有重要意義。

關(guān)鍵詞癌肝細(xì)胞樹突狀細(xì)胞小鼠

*項(xiàng)目支持：黑龍江省教育廳科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目(11551303)。通訊作者：馬麗

Experimental Study on Therapy of Sensitive Dendritic Cells in Mice Liver Cancer

LIU Yanping#,MA Li.#DepartmentofCadreWard，theFirstAffiliatedHospitalofHarbinMedicalUniversity,HarbinCity，HeilongjiangProvince150001

ABSTRACT Objective:To investigate the role of dendritic cells (DC) pulsed with hepatoma cells in the treatment of mice liver cancer.Methods:Take BALB/c marrow cells from mice tibia and femur bone and use rmIL-4,rmGM-CSF,LPS,RPMI-1640 media in preparation of DC. Inactivated H22 hepatoma cells of mice mixed with DC(1∶3) cultured for preparation of DC(DC-H22) sensitized by hepatoma cells.The experiment were divided into DC treatment group,DC-H22 treatment group and saline-treated control group.Two weeks later,each group were observed changes in tumor volume, tumor inhibition rate and survival after intraperitoneal injection, respectively.Results:(1)Before treatment tumor volume is substantially the same between the groups, two weeks after different treatment,tumor volume of DC treatment group and DC-H22 treatment group compared with saline-treated control group were significantly reduced, indicating that DC and DC-H22 treatment of mice liver cancer significantly inhibited subcutaneous tumor growth, and H22 sensitized DC have more inhibitory effect on tumor growth.(2)After two weeks, the inhibition rates were 31.08%, 68.30% in DC treatment group and the DC-H22 treatment group,the survival of the mice were also longer than the saline control group.Conclusion:Dendritic cells pulsed with mice hepatoma cells are better able to inhibit the growth of liver cancer in mice, they are important for treatment of liver cancer.

KEY WORDS Liver cancer，Hepatoma cells，Dendritic cells，Mice

近二十多年來，腫瘤組織樹突狀細(xì)胞(DC)的存在與腫瘤的轉(zhuǎn)移及預(yù)后的相關(guān)性的研究逐年增多，以DC為基礎(chǔ)的腫瘤疫苗治療也是目前的研究熱點(diǎn)[1，2]。目前DC的體外培養(yǎng)已經(jīng)是一項(xiàng)常用的生物治療技術(shù)，單個(gè)核細(xì)胞來源的DC最為常用。腫瘤疫苗的制備方法可分為四類：(1)特異性腫瘤抗原肽負(fù)載DC；(2)腫瘤細(xì)胞抗原負(fù)載DC；(3)腫瘤細(xì)胞-DC融合體疫苗；(4)腫瘤細(xì)胞RNA或cDNA負(fù)載DC[3]。本實(shí)驗(yàn)制備小鼠H22肝癌細(xì)胞致敏的DC(即肝癌-DC融合疫苗)，觀察其對(duì)小鼠皮下移植肝癌的抑制作用及肝癌小鼠生存期的影響，模擬臨床肝癌的治療過程，為進(jìn)一步應(yīng)用于臨床肝癌的治療和防止復(fù)發(fā)奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料雌性BALB/c小鼠，4~6周，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。小鼠肝癌H22細(xì)胞株，購(gòu)自上海拜力生物科技有限公司。主要試劑：重組小鼠粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(recombinant mouse granulocyte-maerophage colony stinalating factor,rmGM-CSF),重組白細(xì)胞介素4(recombinant mouse interleukin 4,rmIL-4)、購(gòu)自美國(guó)PeproTech公司，脂多糖(Lipopolysacchrides,LPS)購(gòu)自Sigma公司。RPMI-1640培養(yǎng)基，購(gòu)自Gibco公司?？剐∈驝D1a-FITC、抗小鼠CD86-FITC，購(gòu)自BD Pharmingen公司。抗小鼠CD11c-PE、抗小鼠CD80-PE-Cy5，購(gòu)自eBioscience公司。

1.2小鼠骨髓DC的制備將BALB/c小鼠頸椎離斷處死，取其脛骨和股骨，用1ml注射器吸取RPMI-1604培養(yǎng)基，刺穿骨骺端沖洗骨髓腔，將所得懸液離心、洗滌，重懸細(xì)胞于10%胎牛血清的RPMI-1604培養(yǎng)基。調(diào)整收獲的骨髓細(xì)胞的濃度至1×105/ml~1×106/ml，加入rmIL-4(終濃度10ng/ml)和rmGM-CSF(終濃度20ng/ml)培養(yǎng)，保留貼壁細(xì)胞；隔日半量換液，培養(yǎng)至第6天收集所有吹吸后的懸浮細(xì)胞。調(diào)整收集細(xì)胞的濃度為1×105/ml~1×106/ml，加入LPS刺激24h使其成熟，用0.4%臺(tái)盼藍(lán)染色后，用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)活細(xì)胞數(shù)，活細(xì)胞數(shù)在95%以上，進(jìn)行DC的光鏡觀察。

1.3DC表面標(biāo)記分子的檢測(cè)收集最終制備的懸浮細(xì)胞，用磷酸鹽緩沖液洗兩遍(1 000r/min離心，5min)，用流式細(xì)胞儀專用細(xì)胞固定液調(diào)整細(xì)胞濃度至1×106/ml，取300μl細(xì)胞懸液分別加入1μl的抗小鼠CD1a-FITC抗體、抗小鼠CD11c-PE抗體、抗小鼠CD80-PE-Cy5抗體、抗小鼠CD86-FITC抗體，并避光孵育30min。用2ml的流式細(xì)胞儀專用細(xì)胞固定液洗兩遍(1 000r/min離心5min)，重懸細(xì)胞后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)熒光標(biāo)記。

1.4H22肝癌細(xì)胞致敏的DCH22小鼠肝癌細(xì)胞以30μg/ml絲裂霉素滅活后與DC按1∶3混合，以50%PEG 37℃作用lmin，RPMI-1640培養(yǎng)基稀釋后培養(yǎng)24h。

1.5建立皮下荷瘤鼠模型將生長(zhǎng)良好處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的H22 細(xì)胞接種于小鼠右后腿根部，細(xì)胞濃度5×105/只，建立皮下荷瘤小鼠模型，2周后可見所有接種小鼠均生長(zhǎng)出腫瘤，3~4周后待小鼠腫瘤平均直徑長(zhǎng)至0.8cm左右即可用于實(shí)驗(yàn)。

1.6動(dòng)物分組BALB/c小鼠隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組，每組12只。觀察指標(biāo)：腫瘤體積、抑瘤率、生存期。實(shí)驗(yàn)組分為DC治療組、DC-H22治療組，對(duì)照組為生理鹽水治療組。DC及DC-H22注射治療2周后再次皮下注射H22肝癌細(xì)胞(每組4只)。

1.7DC接種給荷瘤小鼠腹腔內(nèi)注射DC、DC-H22、生理鹽水，1周后重復(fù)注射，2周后測(cè)量腫瘤直徑，計(jì)算腫瘤體積、抑瘤率。公式：V=LW2/2(mm3)，V為體積，L為瘤體的最大直徑，W為垂直直徑。抑瘤率(%)=[1-(治療組開始平均瘤體積-治療組結(jié)束平均瘤體積)/(對(duì)照組開始瘤體積-對(duì)照組結(jié)束平均瘤體積)]×100%。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)分析用SPSS17.0，各組腫瘤體積的比較用One-Way ANOVA方差分析，生存期比較用單因素方差分析。

2結(jié)果

2.1DC光鏡下形態(tài)觀察分離的骨髓細(xì)胞體積小、圓形，經(jīng)rmIL-4、rmGM-CSF和LPS作用后，觀察到呈半貼壁狀態(tài)的細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則、大小不一、聚集成團(tuán)，逐漸發(fā)展為貼壁生長(zhǎng)、胞體增大、樹突狀突起，在高倍鏡下細(xì)胞表面可觀察到較多毛刺樣突起，呈現(xiàn)典型的成熟DC形態(tài)。

2.2細(xì)胞表型特征制備的DC，CD1a、CD11c及CD86、CD80呈現(xiàn)高表達(dá)。

2.3DC對(duì)腫瘤體積的影響見表1。

表1　三組治療對(duì)H22荷瘤小鼠腫瘤體積的影響(mm3)

單因素方差分析(體積變化)結(jié)果：(1)方差齊性檢驗(yàn)Levene檢驗(yàn)，P=0.580，可認(rèn)為方差齊(P>0.05)。(2)方差分析表(ANOVA)表明，F(xiàn)=79.214，Sig=0.000，按α=0.05水準(zhǔn)，拒絕H0，接受H1，故可認(rèn)為三組的治療前、后體積變化有差別。(3)多重比較檢驗(yàn)(Post Hoc Tests)表明，三組之間的體積變化有顯著性差別(P<0.05)。說明：治療前各組間的腫瘤體積基本相同，不同治療2周后，DC治療組、DC-H22治療組小鼠腫瘤體積較生理鹽水治療的對(duì)照組顯著性減小，說明DC及DC-H22治療小鼠肝癌可以顯著抑制皮下移植腫瘤的生長(zhǎng)，而致敏的DC對(duì)腫瘤的抑制程度更大。

2.4抑瘤率及生存期觀察見表2。單因素方差分析(生存期)結(jié)果：(1)方差齊性檢驗(yàn)Levene檢驗(yàn)，P=0.565，可認(rèn)為方差齊(P>0.05)。(2)方差分析表(ANOVA)表明，F(xiàn)=71.146，Sig=0.000，按α=0.05水準(zhǔn)，拒絕H0，接受H1，故可認(rèn)為三組的生存期有差別。(3)多重比較檢驗(yàn)(Post Hoc Tests)表明，三組之間的體積變化有顯著性差別(P<0.05)。說明：DC治療組、DC-H22組治療2周后，其抑瘤率分別為31.08%、68.3%，小鼠的存活期亦較生理鹽水對(duì)照組延長(zhǎng)。

表2　三組治療對(duì)H22荷瘤小鼠治療后

2.5復(fù)種H22肝癌細(xì)胞治療2周后再次于對(duì)側(cè)后腿根部皮下接種H22肝癌細(xì)胞，荷瘤小鼠未見明顯抑瘤作用。

3討論

近 20 余年來，有關(guān)腫瘤組織中DC浸潤(rùn)程度與腫瘤轉(zhuǎn)移及臨床預(yù)后關(guān)系的報(bào)道陸續(xù)出現(xiàn)，DC 的

基礎(chǔ)性研究及以DC 為基礎(chǔ)的腫瘤疫苗治療正成為研究的熱點(diǎn)[4，5]。利用DC來誘導(dǎo)機(jī)體抗腫瘤免疫已成為腫瘤免疫治療的新途徑，其核心問題是如何在體外進(jìn)行DC腫瘤抗原的特異性修飾，從而發(fā)揮最大的特異性抗腫瘤作用。

本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用H22肝癌細(xì)胞致敏的DC治療荷瘤小鼠，結(jié)果顯示治療前各組間的腫瘤體積基本相同，不同治療2周后，DC治療組、DC-H22治療組小鼠腫瘤體積較生理鹽水治療的對(duì)照組顯著性減小，說明DC及DC-H22治療小鼠肝癌可以顯著抑制皮下移植腫瘤的生長(zhǎng)，而H22肝癌細(xì)胞致敏的DC對(duì)腫瘤的抑制程度更大，發(fā)揮特異性抗腫瘤作用。DC治療組和DC-H22治療組其抑瘤率分別為31.08%、68.30%，治療后小鼠的進(jìn)食情況、活動(dòng)度等基本生命指標(biāo)明顯優(yōu)于對(duì)照組，其存活期亦較鹽水對(duì)照組延長(zhǎng)。

本實(shí)驗(yàn)可以觀察到DC及H22肝癌細(xì)胞致敏的DC治療荷瘤小鼠后，無論是腫瘤體積還是生存期均有改善。但能否影響腫瘤的復(fù)發(fā)尚不確定，融合性后抗原遞呈作用持續(xù)多久、抗腫瘤時(shí)間也不確定，可以發(fā)揮最大抗腫瘤作用的接種次數(shù)及間隔時(shí)間也還是未知數(shù)。本實(shí)驗(yàn)也經(jīng)過DC及DC-H22治療后復(fù)種H22肝癌細(xì)胞，但并未觀察到無瘤生存現(xiàn)象，考慮與接種次數(shù)及間隔時(shí)間和小鼠的生存期短的干擾有關(guān)，需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究。

DC的體外制備目前雖已較為成熟，但是如何增強(qiáng)其靶向性、特異性、持久性，仍是臨床腫瘤治療中一個(gè)艱巨的挑戰(zhàn)。未來還需要針對(duì)腫瘤特殊的免疫抑制環(huán)境，整合 DC 疫苗以及其他的免疫治療模式，形成更強(qiáng)大的腫瘤免疫治療組合。

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(編輯雅文)

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收稿日期2015-09-04

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